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Nov 06, 2023

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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5938 (2023) Citar este artículo 610 Accesos Detalles de métricas Los conservantes químicos de alimentos se encuentran ampliamente en varios productos alimenticios procesados ​​en el

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 5938 (2023) Citar este artículo

610 Accesos

Detalles de métricas

Los conservantes químicos de alimentos se encuentran ampliamente en diversos productos alimenticios procesados ​​en el entorno humano. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto de la exposición a largo plazo a cinco conservantes alimentarios (sorbato de potasio (PS), hidroxianisol butilado (BHA), benzoato de sodio (SB), propionato de calcio (CP) y ácido bórico (BA)). sobre el hígado y el riñón en ratas y los probables mecanismos subyacentes. Durante 90 días, sesenta ratas albinas macho recibieron por vía oral agua (control), 0,09 mg/kg de peso corporal de BHA, 4,5 mg/kg de peso corporal de PS, 0,9 mg/kg de peso corporal de SB, 0,16 mg/kg de peso corporal b. peso BA, o 0,18 mg/kg b.wt CP. Se evaluaron pruebas de función hepática y renal. Se estimaron biomarcadores de estrés oxidativo hepático y renal. Se logró el análisis histológico de los tejidos del hígado y el riñón. Niveles de expresión de ARNm de los receptores tipo peaje 2 y 4 (TLR-2 y TLR-4), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y el factor nuclear potenciador de la cadena ligera kappa de las células B activadas (NF-κB) se midieron. Los resultados revelaron que la dosificación oral a largo plazo de los cinco conservantes alimentarios produjo aumentos significativos en los niveles de fosfatasa alcalina, alanina transaminasa, aspartato transaminasa, urea, ácido úrico y creatinina. Hubo reducciones significativas en las enzimas antioxidantes hepáticas y renales, un aumento en las concentraciones de MDA y alteraciones patológicas en los tejidos renales y hepáticos. Los niveles de ARNm de TLR-4, TLR-2, NF-κB y TNF-α estaban elevados en los grupos expuestos a conservantes alimentarios. En conclusión, los hallazgos actuales revelaron que la exposición prolongada a PS, BHA, SB, CP y BA tiene un impacto negativo en la función hepática y renal. Además, estos efectos negativos podrían estar mediados por la inducción del estrés oxidativo, reacciones inflamatorias y producción de citoquinas.

La conservación de alimentos ha tenido tradicionalmente tres objetivos: conservar el aspecto de los alimentos, preservar las propiedades nutricionales de los alimentos y extender la vida útil de los alimentos1,2. Los antioxidantes y los agentes antimicrobianos se encuentran entre los casi 3.000 conservantes alimentarios que se encuentran actualmente en el mercado3. El sorbato de potasio (PS), el hidroxitolueno butilado (BHT), el benzoato de sodio (SB), el hidroxianisol butilado (BHA), el glutamato monosódico, el bromato de potasio, el ácido bórico (BA) y el propionato de calcio (CP) son los conservantes alimentarios más utilizados4. Actualmente, las preocupaciones en torno a las implicaciones para la salud que plantean los conservantes químicos han llevado a la necesidad de una evaluación exhaustiva de sus impactos, especialmente con la exposición a largo plazo5.

El hidroxianisol butilado (BHA, C11H16O2, E320) es un aditivo alimentario y se puede agregar a los materiales de embalaje para proteger los alimentos dentro del paquete al volatilizar el antioxidante6. No es irritante, pero su bajo potencial de sensibilización alérgica puede producir respuestas cutáneas (dermatitis alérgica de contacto). Posiblemente sea cancerígeno para los humanos7.

Varios productos de consumo incluyen sorbato de potasio (PS, C6H7O2K, E202), que inhibe el crecimiento de levaduras y mohos y controla el crecimiento de ciertas bacterias8. El PS está presente en muchos alimentos como quesos, encurtidos, salsas, productos pesqueros y refrescos como agente antimicrobiano9, y se ha demostrado que tiene efectos mutagénicos y/o genotóxicos10. Tanto el SB como el PS pueden sobrecargar el hígado, provocar sensibilización y alterar el comportamiento de los niños11.

El benzoato de sodio (SB, C7H5O2Na, E211) es un conservante de uso frecuente en alimentos y bebidas. Es un conservante de refrescos popular porque inhibe el crecimiento de bacterias y hongos en el ambiente ácido de las bebidas carbonatadas. También se utiliza en ensaladas, bebidas carbonatadas, mermeladas, jugos de frutas y en la industria farmacéutica para mantener frescos los medicamentos líquidos12. Después de la exposición oral, cutánea o por inhalación a SB, se han informado urticaria, asma, rinitis o shock anafiláctico. Poco después de la exposición, los síntomas desaparecen en unas pocas horas7.

El ácido bórico (BA, H3BO3, E284) se utiliza en diversos cosméticos y medicamentos para uso humano, así como en productos antibacterianos y antifúngicos y en productos veterinarios13. Los compuestos que contienen boro se utilizan en diversos bienes de consumo, en particular vidrio y cerámica, agentes impermeabilizantes e ignífugos, fertilizantes y herbicidas14. Después de una exposición oral, sistémica o cutánea, el BA es peligroso para humanos y animales en grandes concentraciones15. Previamente se detectaron alteraciones degenerativas en hígado, riñón y cerebro, y cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos en células acinares pancreáticas16.

El propionato de calcio (CP, C6H10CaO4, E282) es una sal orgánica que se forma cuando el hidróxido de calcio y el ácido propiónico reaccionan juntos17. La CP es un conservante potente con poco o ningún sabor que funciona bien contra las bacterias y el moho y se utiliza ampliamente en piensos, alimentos y medicamentos18. Si bien el consumo de PC puede no ser tóxico en dosis altas, su exposición a largo plazo puede tener consecuencias para la salud, como ansiedad, alucinaciones visuales, hiperactividad y trastornos del sueño19. Además, se ha informado que la exposición prolongada a niveles elevados de PC provoca impactos inmunotóxicos y hematotóxicos20.

Según las edades de los consumidores, localidades y metodologías de estimación, el consumo medio diario de BHA oscila entre 0,002 mg/kg/día y 0,3 mg/kg/día21. Las concentraciones de 25 mg PS/kg, 5 mg SB/kg22 y 1 mg CP/kg23 se informaron como ingestas diarias aceptables de conservantes alimentarios. El Ministerio de Agricultura de Turquía24 declaró que el BA se puede utilizar como conservante de alimentos hasta 4 g/l (4000 mg/l).

Los aditivos alimentarios actúan como xenobióticos a los que los seres humanos están expuestos25. El hígado es responsable de una parte importante del metabolismo xenobiótico26. La célula del túbulo renal produce citocinas proinflamatorias que responden directamente a infecciones o toxinas27. Estas células funcionan como células proinflamatorias o respondedoras del sistema inmunológico, son cruciales en el desarrollo de la disfunción renal28.

Los receptores tipo Toll (TLR) son componentes importantes del sistema inmunológico hepático que desempeñan un papel vital en la fisiología y patología del hígado29. Los TLR-1, 2, 3, 4 y 6 se expresan mediante células epiteliales tubulares en el riñón. TLR-4 es abundante en los túbulos proximales y colectores30. La expresión de la proteína TLR-2 también ha estado presente en varios tipos de células del riñón (túbulos, médula, glomérulos y vasculatura renal)31. Los receptores del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y los TLR pueden activar el potenciador de la cadena ligera kappa del factor nuclear de las células B activadas (NF-κB). Este factor de transcripción mejora en gran medida la supervivencia y proliferación celular32. El nivel de NF-κB aumentó significativamente en respuesta a mayores dosis de aditivos alimentarios33. NF-κB es un actor clave en la vía de señalización de TLR-4 y desempeña un papel en la respuesta inflamatoria34.

En nuestro estudio anterior, la dosificación oral durante 90 días de los cinco conservantes alimentarios (PS, BHA, BA, SB y CP) alteró significativamente los componentes inmunes innatos y humorales20. Sin embargo, muy pocos estudios exploraron el daño oxidativo y la inducción de inflamación en los órganos del hígado y el riñón después de una exposición prolongada a PS, BHA, BA, SB y CP. El presente estudio evaluó y comparó algunos efectos tóxicos y alteraciones metabólicas generadas por PS, BHA, BA, SB y CP. Además, el trabajo actual investigó los cambios histopatológicos en los tejidos del hígado y el riñón después de la exposición a conservantes alimentarios. Además, los niveles de ARNm de TLR-2 y 4 hepáticos y renales, NF-κB y TNF-α se estudiaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-PCR).

PS, BHA, BA, SB y CP se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Todos los demás productos químicos y reactivos eran de calidad analítica.

Se compraron ratas albinas macho adultas (n = 60, peso promedio 160 ± 5 g) de la sección de cría del Centro Nacional de Investigación (Giza, Egipto). Todas las ratas se mantuvieron en jaulas de malla de acero limpias y bien ventiladas en un ambiente controlado (50–60% de humedad relativa, 20–24 °C, ciclo de luz-oscuridad de 12 h). Durante todo el experimento, las ratas tuvieron acceso ilimitado a agua del grifo y a comida normal para roedores. Las ratas fueron aclimatadas a las circunstancias experimentales durante dos semanas antes de ser estudiadas.

Durante 90 días, se pesaron las ratas y se asignaron arbitrariamente a uno de seis grupos (n = 10) a los que se les administró por vía oral agua destilada, 4,5 mg PS/kg b.wt22, 0,09 mg BHA/kg b.wt21, 0,16 mg BA/kg b.wt24, 0,9 mg de SB/kg b.wt22, o 0,18 mg CP/kg b.wt23. Todos los conservantes alimentarios se consumieron por vía oral mediante sonda orogástrica entre las 8 am y las 10 am. Cada semana, la cantidad de conservantes alimentarios adquiridos se modificó en función de las fluctuaciones del peso corporal de las ratas. Durante el ensayo se controlaron de cerca el dolor, el malestar, los daños, el comportamiento anormal, la angustia, los patrones de respiración, el color de las membranas mucosas, la morbilidad y la mortalidad.

El experimento con animales actual se llevó a cabo de acuerdo con los criterios generales de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio en investigaciones científicas y fue aprobado por el comité de investigación de la Universidad de El Cairo sobre la ética del uso de animales (Número de aprobación: VETCU01122022573). Además, el estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE35.

Al final del ensayo (día 90), las ratas ayunaron durante la noche. Luego, las ratas se pesaron y anestesiaron con una inyección intramuscular de clorhidrato de ketamina (50 mg/kg de peso corporal) y xilazina (5 mg/kg de peso corporal). La sangre de todas las ratas se obtuvo en tubos sin anticoagulantes del canto medial. Los tubos se dejaron a temperatura ambiente durante 20 min antes de centrifugarlos a 322 g durante 10 min. El suero se separó cuidadosamente y se almacenó a -20 °C hasta el análisis bioquímico. Luego, las ratas fueron sacrificadas mediante dislocación cervical. Durante la autopsia se extirparon el hígado y los riñones de ratas. Los tejidos del hígado y del riñón se dividieron en tres partes. El primero se transfirió inmediatamente y se almacenó en nitrógeno líquido a -80 °C para su análisis por PCR en tiempo real con una escalera de ARN de 1 ml. Las segundas muestras de hígado y riñón se diseccionaron y almacenaron a -20 °C para preparar un homogeneizado para estimar los biomarcadores de estrés oxidativo. La homogeneización se realizó en una solución fría de tampón NaPOH 0,015 M y NaCl 0,15 M (1:6 p/v; pH 7,8) usando un homogeneizador Ultra-Turrax. Las últimas partes de los tejidos del hígado y el riñón se fijaron con una solución de formalina tamponada al 10% para el examen histopatológico.

Se utilizó un fotómetro semiautomático (5010 V5+, RIELE GmbH & Co, Berlín, Alemania) para evaluar los indicadores de daño hepático y renal a partir de muestras de suero separadas. Las actividades de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se midieron mediante el método de Bergmeyer, et al.36. La actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) sérica se midió utilizando el método descrito por Kind y King37. Según Coulombe y Favreau38 y Fossati, et al.39 se midieron los niveles de urea y creatinina, respectivamente. El nivel de ácido úrico se evaluó siguiendo el protocolo de Barham y Trinder40. Todas las variables bioquímicas se evaluaron utilizando kits comerciales (BioMed Diagnostic Co., El Cairo, Egipto).

Los niveles de catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD) y glutatión reducido (GSH) en homogeneizados de hígado y riñón se determinaron espectrofotométricamente utilizando kits de reactivos de Bio-diagnostic Co., Egipto, de acuerdo con los procedimientos de Sinha41, Nishikimi, et al.42 y Beutler, et al.43, respectivamente. La concentración de malondialdehído (MDA) se determinó mediante un ensayo colorimétrico según el protocolo de Ohkawa et al.44.

El ARN total se extrajo de muestras de tejido hepático y renal utilizando el reactivo TRIzol, según las indicaciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). TaKaRa Bio Inc. proporcionó instrucciones para la PCR cuantitativa en tiempo real utilizando SYBR-green. La Tabla 1 muestra el esquema térmico de la PCR en tiempo real y la secuencia del cebador, con una fase de desnaturalización inicial de 10 min a 95 °C y un paso de extensión final de 10 min a 72 °C. Después de la normalización a β-actina, cada transcripción se cuantificó en tres réplicas mediante la técnica 2-ΔΔCt de Livak y Schmittgen45 para la medición relativa de los niveles de ARNm en muestras de tejido.

Se diseccionaron hígados y riñones de cada animal, se conservaron en una solución de formalina al 10% para su fijación, luego se deshidrataron con grados ascendentes de alcohol, se aclararon en xileno, se incluyeron y se bloquearon en parafina. Se tiñeron secciones de tres micrómetros de espesor con hematoxilina y eosina de acuerdo con el protocolo de Suvarna et al.46. Un patólogo que no tenía idea de a qué grupo pertenecía la rata evaluó los tejidos al azar con un microscopio óptico (Olympus, Tokio, Japón). La puntuación microscópica se calificó en una escala de ausencia de lesión (-) o cambios leves (+), moderados (++) y severos (+++), según Arsad et al.47.

Se utilizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene para verificar la normalidad y la homogeneidad de la varianza de los datos, respectivamente. Cuando se cumplieron los supuestos de normalidad, utilizando IBM SPSS Statistics, versión 21 (IBM; Armonk, Nueva York, EE. UU.)48, los datos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para definir estadísticamente la variación entre grupos, seguido por el análisis múltiple de Tukey. Prueba post hoc de rango para comparaciones por pares. Los datos se han mostrado como medias ± SE para cada grupo. En P <0,05, las diferencias de medias se consideraron significativas. Además, se utilizó GraphPad Prism versión 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) para la presentación de datos49. El análisis de componentes principales se aplicó a las réplicas de análisis bioquímicos y moleculares mediante el método de Granato et al.50.

Los cambios en los indicadores de la función hepatorrenal en las ratas expuestas a BHA, PS, SB, BA o CP durante 90 días se muestran en la Tabla 2. Los niveles séricos de AST y ALT aumentaron significativamente en un 35%, 134%, 123%, 73%. , y 83% y 146%, 99%, 234%, 1607% y 73% en los grupos BHA, PS, SB, BA y CP, respectivamente, en comparación con el grupo de control. La actividad sérica de ALP aumentó significativamente en un 136% y un 690% en los grupos BHA y BA, respectivamente. Mostró una disminución significativa del 60 %, 63 % y 61 % en los grupos PS, SB y CP, respectivamente, en comparación con el grupo de control.

En comparación con el grupo de control, los grupos BHA, PS, SB, BA y CP mostraron un aumento significativo en los niveles séricos de urea (224 %, 137 %, 334 %, 173 % y 187 %, respectivamente) y creatinina sérica (11 %, 10%, 9%, 24% y 49%, respectivamente). Los grupos SB, BA y CP tuvieron niveles séricos de ácido úrico significativamente más altos que el grupo control en un 26%, 45% y 82%, respectivamente (Tabla 2).

La Tabla 2 muestra los cambios en los indicadores de estrés oxidativo hepático en ratas tratadas continuamente con BHA, PS, SB, BA o CP durante 90 días. Los niveles de SOD hepática se redujeron significativamente en un 8%, 40%, 39%, 46% y 17% en los grupos BHA, PS, SB, BA y CP, respectivamente, en comparación con el grupo de control. Los niveles de CAT hepático se redujeron significativamente en un 57 %, 54 %, 68 % y 24 % en los grupos PS, SB, BA y CP, respectivamente, en comparación con el grupo de control. Además, los niveles hepáticos de GSH se redujeron significativamente en un 51%, 50%, 57% y 22% en los grupos PS, SB, BA y CP, respectivamente, en comparación con el grupo de control. En comparación con el grupo de control, los grupos PS, SB y BA mostraron un aumento significativo en los niveles hepáticos de MDA (102%, 108% y 136%), respectivamente.

En cuanto a los indicadores de estrés oxidativo renal en ratas expuestas a BHA, PS, SB, BA o CP durante 90 días, los niveles renales de SOD, CAT y GSH se redujeron significativamente en un 35%, 31%, 43% y 15%. y en un 56%, 52%, 59% y 20% y en un 55%, 51%, 60% y 17% en los grupos PS, SB, BA y CP, respectivamente, en comparación con el grupo de control. En comparación con el grupo de control, los grupos PS, SB, BA y CP tuvieron niveles de MDA renal significativamente más altos que el grupo de control (138 %, 128 %, 167 % y 50 %, respectivamente) (Tabla 2).

Las Figuras 1A, B demuestran los efectos de la dosis oral de BHA, PS, SB, BA y CP durante 90 días sobre los niveles medios de expresión de ARNm de TLR-2 y TLR-4 hepáticos. La expresión hepática de TLR-4 aumentó significativamente en 5,52, 1,95, 1,24, 3,21 y 2,10 veces en los grupos BHA, PS, SB, BA y CP, respectivamente, en relación con el grupo de control. La expresión media de TLR-2 hepático aumentó 4,26, 1,32, 1,18, 2,65 y 1,82 veces en los grupos BHA, PS, SB, BA y CP, respectivamente, en comparación con el grupo de control.

Expresión de los receptores tipo peaje 2 (TLR2) y receptores tipo peaje 4 (TLR4) en los tejidos hepático y renal de hidroxianisol butilado (BHA), sorbato de potasio (PS), benzoato de sodio (SB), ácido bórico (BA), o ratas tratadas con propionato de calcio (CP). Se utilizó β-actina como control interno. Los datos se expresan como la media ± SE (n = 3 réplicas). Las columnas con diferentes superíndices son significativamente diferentes (ANOVA unidireccional, p <0,05).

En los grupos BHA, PS, BA y CP, la expresión renal de TLR-4 se elevó considerablemente en 4,25, 1,72, 2,62 y 1,45 veces, respectivamente, en relación con el grupo de control. En los grupos BHA, PS, SB, BA y CP, la expresión media de TLR-2 renal se elevó 3,98, 1,41, 1,22, 2,20 y 1,45 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de control (Fig. 1C,D).

En el hígado, la expresión de NF-κB aumentó significativamente en 6,46, 2,14, 1,31, 2,89 y 1,81 veces en respuesta a la exposición a BHA, PS, SB, BA y CP, respectivamente, en relación con el control. La expresión de TNF-α también se elevó considerablemente en 2,55, 2,12, 1,84, 3,28 y 1,85 veces en los grupos BHA, PS, SB, BA y CP, respectivamente, en comparación con el grupo de control (Fig. 2A, B). Mientras que la expresión renal de NF-κB y TNF-α se incrementó significativamente en 4,89, 1,64, 1,36, 2,20 y 1,48 veces y en 2,32, 1,64, 1,36, 2,85 y 1,28 veces en respuesta a BHA, PS, SB, BA y Exposición a CP, respectivamente, en comparación con el control (Fig. 2C, D).

Expresión del factor nuclear kappa B (NF-κB) y del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en los tejidos hepático y renal de hidroxianisol butilado (BHA), sorbato de potasio (PS), benzoato de sodio (SB), ácido bórico. (BA) o ratas tratadas con propionato de calcio (CP). Se utilizó β-actina como control interno. Los datos se expresan como la media ± SE (n = 3 réplicas). Las columnas con diferentes superíndices son significativamente diferentes (ANOVA unidireccional, p <0,05).

La apariencia macroscópica del hígado del grupo control mostró una apariencia normal, mientras que los grupos tratados mostraron hepatomegalia y congestión. Microscópicamente, el grupo de control normal mostró una arquitectura normal del tejido hepático con hepatocitos claramente definidos alrededor de la vena central y cordones hepáticos bien dispuestos entre los sinusoides y los conductos biliares normales (Fig. 3A). Mientras que los grupos tratados revelaron que el patrón lobulillar normal de los cordones hepáticos estaba distorsionado, lo que provocaba la dilatación de algunos sinusoides y la obliteración de otros. Se observaron cambios degenerativos vacuolares periportales de hepatocitos con núcleos picnóticos y proliferación de células de Kupffer. Hubo pérdida nuclear o hepatocitos binucleados. En la zona portal se detectaron infiltraciones focales y/o difusas de células inflamatorias mononucleares, principalmente linfocitos y macrófagos. La vena central y los sinusoides hepáticos estaban dilatados y congestionados, y se observó dilatación de los vasos linfáticos. También se observó edema interlobulillar. Se observaron hiperplasia de los conductos biliares y destrucción epitelial con conductos biliares recién formados y se asociaron con fibrosis periportal. La gravedad de estas alteraciones patológicas difirió según el material tratado entre los diferentes grupos, como se menciona en la Tabla 3. Se volvieron más pronunciadas en BA (Fig. 3H), BHA (Fig. 3B, C) y SB (Fig. 3F). , G) grupos tratados, seguidos de los grupos tratados con PS (Fig. 3D, E) y luego con CP (Fig. 3I).

Fotomicrografías histopatológicas representativas de secciones transversales de hígados de rata teñidas con hematoxilina. (A) Grupo de control: muestra una arquitectura normal con hepatocitos normales en los cordones hepáticos (H) y la vena central (CV) (tinción H&E, × 100). Grupo tratado con butilhidroxianisol: (B) que muestra desorganización de los hepatocitos (H), vena central (CV) dilatada y congestionada, infiltraciones de células inflamatorias (I) en el área porta, conductos biliares dilatados (N) y fibrosis periportal (F) ( Tinción H&E × 100). (C) que muestra la vena central (CV) y los sinusoides (S) dilatados y congestionados, infiltraciones de células inflamatorias (I) en el área porta e hiperplasia del conducto biliar (B) (tinción H&E, × 400). Grupo tratado con sorbato de potasio (D): que muestra desorganización de los hepatocitos (H) y vena central (CV) congestionada (tinción H&E × 40). (E) que muestra cambios degenerativos de los hepatocitos (H) con núcleos picnóticos, vena central (CV) congestionada, sinusoides sanguíneos dilatados e infiltraciones de células inflamatorias (I) en el área porta (tinción H&E, × 400). Grupo tratado con benzoato de sodio que muestra: (F) hepatocitos, cordones desorganizados (H), vena central congestionada (CV), infiltraciones leucocíticas mononucleares (I), conductos biliares recién formados (N) y fibrosis (F) en el área porta (H&E). mancha, × 100). (G) Cambios degenerativos periportales de hepatocitos (H) con núcleos picnóticos, pérdida nuclear (L) o hepatocitos binucleados (BH), vena central (CV) dilatada y congestionada y dilatación de los sinusoides hepáticos (S) (tinción H&E, × 400) . Grupo tratado con ácido bórico que muestra: (H) vena porta (CV) congestionada, infiltraciones de células inflamatorias (I) en el área porta, conductos biliares recién formados (N) y fibrosis portal (F) (tinción H&E, × 100). Grupo tratado con propionato de calcio que muestra: (I) vena porta (CV) y sinusoides hepáticos (S) congestionados, así como cambios degenerativos de los hepatocitos (H) con núcleos picnóticos (tinción H&E, × 400).

A simple vista, los riñones del grupo de control no mostraron anomalías graves, mientras que los del tratamiento con BHA, PS y BA parecían congestionados y agrandados y los riñones de rata tratados con SB y CP eran pequeños y pálidos. El examen histológico no mostró alteraciones histoarquitectónicas con corteza y médula normales. Había un glomérulo bien desarrollado, una cápsula de Bowman y túbulos contorneados proximales y distales en los riñones del grupo de control (Fig. 4A). Como se muestra en la Fig. 4, en los animales que recibieron tratamiento con BHA (Fig. 4B, C), PS (Fig. 4D, E) y BA (Fig. 4H, I), las secciones de tejido renal mostraron una marcada degeneración granular en los túbulos renales. células. Había inflamación celular con bordes celulares indistintos y núcleos picnóticos. Se observó descamación del epitelio que recubre los túbulos renales. Había proteína eosinófila en la luz de algunos túbulos renales, estrechando la luz del túbulo mientras dilataba otros. Se observó una contracción moderada de los glomérulos con un espacio de Bowman ligeramente dilatado, engrosamiento de la membrana basal glomerular y congestión del penacho glomerular y hemorragia. Se observó nefritis intersticial focal con infiltraciones leucocíticas. Además, hubo congestión de vasos sanguíneos intertubulares con vasculitis y edema intersticial.

Microfotografías histopatológicas representativas de secciones transversales de riñones de rata teñidas con hematoxilina. (A) Grupo de control: muestra una estructura normal con glomérulos renales (G) y túbulos (T) (tinción H&E, × 100). El grupo tratado con hidroxianisol butilado muestra: (B) cambios degenerativos en las células tubulares renales (T), infiltraciones leucocíticas focales (I) y congestión de los vasos sanguíneos intertubulares (C) (tinción H&E × 100). (C) Degeneración granular en las células tubulares renales (T), epitelio descamado (D), inflamación celular con núcleos picnóticos (N), congestión de los vasos sanguíneos intertubulares (C) con vasculitis (V) (tinción H&E, × 400). Grupo tratado con sorbato de potasio que muestra: (D) degeneración de los túbulos renales (T), congestión de los vasos sanguíneos intertubulares (BV) y del penacho glomerular (C), nefritis intersticial focal (I), contracción glomerular (G) (tinción H&E, × 100 ). (E) Degeneración granular tubular (T) y congestión de vasos sanguíneos intertubulares (BV) (tinción H&E, × 400). El grupo tratado con benzoato de sodio muestra: (F) glomerulonefritis intersticial crónica (N) con inflamación turbia de los túbulos (T) y congestión de los vasos sanguíneos intertubulares (BV) (tinción H&E × 100). (G) nefritis intersticial crónica con citoplasma vacuolado y núcleos picnóticos, células epiteliales degeneradas y descamadas e infiltraciones leucocíticas principalmente neutrófilos dentro de los túbulos (T), así como infiltrados de células inflamatorias intersticiales (I) (tinción H&E, × 400). Grupo tratado con ácido bórico que muestra: (H) inflamación de las células tubulares (T), congestión de los vasos sanguíneos intertubulares y del penacho glomerular (G), infiltraciones leucocíticas intersticiales (I) y edema glomerular (E) y encogimiento (tinción H&E, × 100 ). (I) Degeneración vacuolar en células tubulares renales (T), descamación del epitelio de revestimiento, estrechamiento de la luz tubular y congestión de los vasos sanguíneos intertubulares (BV) (tinción H&E, × 400). Grupo tratado con propionato de calcio que muestra: (J) glomerulonefritis intersticial crónica con túbulos dilatados y llenos de células degeneradas, infiltraciones leucocíticas y células epiteliales descamadas (T), infiltrados de células inflamatorias intersticiales (I) (tinción H&E, × 100). (K) Células degeneradas, infiltraciones leucocíticas, células epiteliales descamadas dentro de túbulos dilatados (T), infiltrados de células inflamatorias intersticiales (I) y atrofia tubular (tinción H&E, × 400). (L) Glomerulonefritis intersticial crónica con atrofia de los túbulos (T), fibrosis intersticial (F) e infiltrados de células inflamatorias (I), así como edema glomerular, hiperemia y encogimiento (G) (tinción H&E, × 400).

Por otro lado, el riñón de rata tratado con SB (Fig. 4F, G) y CP (Fig. 4J-L) se caracterizó por una glomerulonefritis intersticial crónica notable con cambios degenerativos graves. Tanto los túbulos contorneados proximales como los distales estaban dilatados con células epiteliales descamadas y degeneradas e infiltraciones leucocíticas, principalmente neutrófilos. La degeneración granular aumentó en algunos túbulos, mientras que otros aparecieron muy hinchados y disociados con citoplasma vacuolado, bordes celulares indistintos y núcleos picnóticos. Las características histológicas de ambos grupos fueron fibrosis intersticial multifocal y/o difusa e infiltración de células inflamatorias con números variables de linfocitos, macrófagos, histiocitos, células plasmáticas y pocos neutrófilos. Se detectó atrofia tubular con una membrana basal prominentemente engrosada y arrugada y una luz estrecha o nula. Además, otros túbulos con frecuencia experimentaron una luz dilatada compensatoria y la formación del cilindro hialino. Además, el corpúsculo renal también resultó dañado, incluido edema glomerular, engrosamiento del sótano y glomérulos reducidos. Hubo congestión del penacho glomerular y de los vasos sanguíneos intertubulares asociada con vasculitis. La gravedad de los daños renales previos difirió entre los diferentes grupos, como se menciona en la Tabla 4.

Se utilizó el análisis de componentes principales para probar los vínculos entre los parámetros séricos de la función hepática y renal y el estrés oxidativo y los indicadores de lípidos y las expresiones de los genes TLR-4, TLR-2, NF-κB y TNF-α en tejidos hepáticos y renales. Se trazó la gráfica de carga de los dos primeros componentes, como se muestra en la Fig. 5, y ambos componentes representaron aproximadamente el 97,91% de la variación general en los datos experimentales. En el gráfico de carga, las variables estrechamente asociadas (< 90°) tienen fuertes correlaciones y están correlacionadas positivamente entre sí. En consecuencia, las variables que incluyen enzimas hepáticas (ALT, AST y ALP), productos de daño renal (urea, ácido úrico y creatinina) y marcadores de peroxidación lipídica (MDA) y TLR-4, TLR-2, NF-κB y Las expresiones del gen TNF-α en los tejidos hepático y renal están agrupadas y altamente correlacionadas con el primer componente. Además, las variables de antioxidantes hepáticos y renales, incluidos GSH, SOD y CAT, se agruparon y correlacionaron con el segundo componente. Las enzimas hepáticas, los productos de daño renal y la peroxidación lipídica y las expresiones de los genes TLR-4, TLR-2, NF-κB y TNF-α en los tejidos hepáticos y renales se correlacionaron altamente negativamente con los contenidos de antioxidantes hepáticos y renales.

El gráfico de análisis de componentes principales muestra las relaciones de las variables estimadas. (A) Proporción acumulada de varianza en función del número de componentes principales (PC). (B) Todos los indicadores bioquímicos y de expresión genética se trazan en función de PC1 y PC2, que representan el 89,32% y el 8,59% de la varianza, respectivamente. H_ hepática, R_ renal, AST aspartato transaminasa, ALT alanina transaminasa, ALP fosfatasa alcalina, MDA malondialdehído, SOD superóxido dismutasa, CAT catalasa, GSH glutatión reducido, NF-κB factor nuclear potenciador de cadena ligera kappa de células B activadas, TLR -2 receptores tipo peaje 2, receptores tipo peaje TLR-4 4, factor de necrosis tumoral alfa TNF-α.

El hígado es el principal sitio del metabolismo xenobiótico y, en consecuencia, es muy susceptible a sus impactos nocivos27,51. En el estudio actual, se detectó un marcado deterioro de la función hepática en las ratas que recibieron BHA, PS, SB, BA y CP por vía oral durante 90 días, lo que se reflejó en un aumento significativo en los niveles séricos de AST y ALT que los de control. Estos hallazgos podrían estar relacionados con las perturbaciones patológicas inducidas por los aditivos alimentarios probados en los tejidos hepáticos, incluida la degeneración vacuolar de los hepatocitos con núcleos picnóticos y el crecimiento de células de Kupffer. Cuando se rompe la membrana de los hepatocitos, se liberan enzimas citosólicas al torrente sanguíneo52. Además, el aumento de la actividad de las enzimas AST y ALT podría explicarse por la generación de radicales libres, especialmente en los grupos tratados con PS, SB, BA y CP. Estos radicales libres reaccionan con los ácidos grasos poliinsaturados de la membrana celular, provocando daños en las membranas mitocondriales y plasmáticas y pérdida de enzimas53. Mehedi et al.54 informaron resultados similares.

Las ratas expuestas a BHA y BA tuvieron un nivel de ALP considerablemente aumentado. Por el contrario, los grupos PS, SB y CP mostraron una reducción significativa en los niveles de ALP en comparación con los grupos de control. El aumento en la concentración de ALP puede atribuirse al efecto citotóxico de BHA y BA, que provocó daño a las células hepáticas26. Por otro lado, el efecto inhibidor de PS, SB y CP sobre la actividad de la enzima ALP podría estar relacionado con su interacción con Zn, ya que ALP es una metaloproteína Zn2+. Monanu et al.55 correlacionaron la acción inhibidora de la SB sobre la enzima ALP con su procesamiento agresivo en el hígado a niveles crónicos que pueden sobrecargar el hígado y provocar un mal funcionamiento del mismo.

El riñón es muy susceptible a desarrollar diversas formas de lesión debido a su papel como principal vía excretora de la mayoría de xenobióticos y toxinas56. Estos problemas podrían atribuirse a cambios en el umbral de reabsorción tubular, el flujo sanguíneo renal y la tasa de filtración glomerular26. Los niveles séricos de urea y creatinina se miden comúnmente para evaluar la función renal57,58. Aquí, se registró un aumento sustancial en la urea sérica, la creatinina y el ácido úrico en las ratas que recibieron BHA, PS, SB, BA y CP por vía oral durante 90 días. El aumento de los productos de daño renal en suero también fue concomitante con diversas alteraciones histopatológicas en los tejidos renales de ratas expuestas a conservantes alimentarios, incluida la degeneración granular en las células tubulares renales, la contracción moderada de los glomérulos, la congestión de los vasos sanguíneos intertubulares y el edema intersticial. Tawfek et al.26 informaron previamente hallazgos similares en ratas expuestas a otros aditivos alimentarios como el glutamato monosódico, la tartrazina y el amarillo ocaso. Esto podría deberse al estrés oxidativo y la inflamación detectados en los tejidos renales como resultado de los conservantes alimentarios probados, como lo revelan los hallazgos bioquímicos, moleculares e histopatológicos. Además, BHA, PS, SB, BA y CP podrían haber interferido en el metabolismo de la creatinina, resultando en un aumento de la síntesis, o afectar total o parcialmente la capacidad funcional de excreción tubular de los tejidos59,60.

Se ha sugerido que el estrés oxidativo es un mecanismo subyacente de la toxicidad de muchos conservantes alimentarios61,62. En el experimento actual, las ratas PS, SB, BA y CP que recibieron administración oral mostraron una caída sustancial en los niveles hepáticos y renales de SOD, CAT y GSH. El agotamiento más temprano de los antioxidantes puede deberse a su utilización excesiva para inactivar los radicales libres generados por los aditivos alimentarios probados61. Estas observaciones estaban en línea con el estudio de Yetuk et al.63, que informaron una disminución de las actividades de SOD, CAT, glutatión peroxidasa y GST en los eritrocitos por SB. Además, el aumento de la peroxidación lipídica registrado en el trabajo actual podría estar relacionado con el efecto directo del aumento de la formación de ROS causado por la administración de PS, SB, BA y CP. De manera comparable, otros aditivos alimentarios como el glutamato monosódico, la tartrazina y el amarillo ocaso indujeron estrés oxidativo y peroxidación lipídica en los tejidos renales de ratas26. Además, se ha informado que el BA causa estrés oxidativo y peroxidación lipídica en varios tejidos64,65. Además, el estudio de Khodaei et al.66 informó un aumento significativo en la peroxidación lipídica, una disminución del contenido de GSH y un aumento de la actividad CAT en los tejidos renales de ratones expuestos a SB. Por otro lado, se encontró un cambio no significativo en GSH, CAT, SOD y MDA en los tejidos hepáticos y renales, pero sí una disminución significativa en la SOD hepática en las ratas que consumieron BHA en comparación con el grupo control. En este sentido, el BHA podría aumentar la síntesis de enzimas antioxidantes como mecanismo compensatorio para prevenir el daño renal y hepático67. Además, el anillo aromático contenido en el BHA puede secuestrar ROS de radicales libres, lo que permite estabilizarlos68. De hecho, esta molécula actúa como eliminador de ROS al dar hidrógeno lábil a los radicales de oxígeno formados por los ácidos grasos, lo que da como resultado un ion fenólico oxidado que se estabiliza mediante la resonancia del anillo de benceno69.

El estrés oxidativo puede activar diversos factores de transcripción, lo que resulta en la expresión diferencial de algunos genes implicados en vías inflamatorias70. En el experimento actual, se evaluaron las expresiones de ARNm de los genes TLR-4, TLR-2, NF-κB y TNF-α en tejidos hepáticos y renales. TLR-2 y TLR4 se expresan en todas las células hepáticas y desempeñan un papel en el daño tisular inducido por diversas causas71. Además, TLR-2 y TLR-4 desempeñan un papel imperativo en la fisiopatología de la lesión renal aguda y pueden ser un objetivo terapéutico potencial para disminuir el daño renal en respuesta a diversos estímulos patológicos72,73. En el riñón, la acumulación de ROS y especies reactivas de nitrógeno inducen disfunción renal74, así como un aumento de la expresión de TLR-4 por parte de las células tubulares75. La estimulación de la vía de señales TLR-2 y TLR4 inicia una serie de eventos que incluyen la transferencia de NF-κB al núcleo, la estimulación y la producción de citoquinas inflamatorias (TNF-α, INF-γ e IL-6). )76. El TNF-α, una potente citocina proinflamatoria, desempeña funciones clave en la diferenciación, la inmunidad, la inflamación y la apoptosis77. Además, Matsumura et al.78 informaron que, en condiciones inflamatorias, los hepatocitos se vuelven más reactivos a los ligandos de TLR-2, lo que conduce a una regulación positiva de TLR-2 a través de LPS, TNF-α e IL-1β en un organismo dependiente de NF-κB. manera. En este documento, tanto en los tejidos hepáticos como renales de los grupos expuestos a conservantes alimentarios, una regulación positiva significativa de los genes TLR-4, TLR-2, NF-κB y TNF-α se correlacionó fuertemente con un contenido reducido de antioxidantes (CAT, SOD y GSH). Además, fue evidente una fuerte correlación entre las expresiones de los genes TLR-4, TLR-2, NF-κB y TNF-α y los indicadores de disfunción hepatorrenal. Los hallazgos anteriores implicaron que la exposición prolongada a BHA, BA, SB, PS y CP provocaba reacciones inflamatorias hepáticas y renales probablemente a través de la vía TLR/NF-κB. De acuerdo con nuestros resultados, Yilmaz y Karabay79 encontraron que SB aumentó los niveles de proteína NF-κB-p65 y la activación de NF-κB de las células de cáncer de colon HCT116 en sus concentraciones citotóxicas. Abd-Elhakim et al.20 informaron previamente sobre el aumento significativo en la expresión del gen TNF-α en el tejido esplénico en respuesta a la exposición a BA, BHA, PS, SB y CP. Además, Iheanyichukwu et al.28 observaron un aumento significativo en la expresión del gen TNF-α después de la administración de tartrazina y eritrosina, lo que implica un daño grave o actividad inflamatoria en los riñones de las ratas tratadas. La expresión elevada de TNF-α podría ser en respuesta a la inducción de ROS/estrés oxidativo80 o como resultado de la activación del TLR-2 y 4 cascadas de señalización posteriores, en lugar de ser un resultado directo de la inducción de ROS/estrés oxidativo. En la figura 6 se presentan el estrés oxidativo y las vías inflamatorias propuestas a través de las cuales los cinco conservantes alimentarios indujeron la lesión hepatorrenal.

Presentación esquemática del mecanismo propuesto de daño hepatorrenal inducido por sorbato de potasio (PS), hidroxianisol butilado (BHA), benzoato de sodio (SB), propionato de calcio (CP) y ácido bórico (BA). ALP fosfatasa alcalina, ALT alanina transaminasa, AST aspartato transaminasa, CAT catalasa, CP propionato de calcio, GSH glutatión reducido, MDA malondialdehído, NF-κB factor nuclear potenciador de cadena ligera kappa de células B activadas, SOD superóxido dismutasa, TLR-2 receptores tipo peaje 2, receptores tipo peaje 4 TLR-4, factor de necrosis tumoral alfa TNF-α.

En el estudio actual, la dosificación oral durante 90 días de cinco conservantes alimentarios (PS, BHA, BA, SB y CP) en un modelo de rata mostró un aumento significativo en la fuga de enzimas hepáticas, los niveles séricos de productos de daño renal, las enzimas antioxidantes agotadas y diversas perturbaciones histopatológicas en los tejidos renal y hepático. La regulación positiva de los genes TLR-4, TLR-2, NF-κB y TNF-α hepáticos y renales podrían ser probables mecanismos subyacentes. El ácido bórico mostró los efectos más perjudiciales en el hígado y los riñones, seguido del BHA y el PS. En general, los hallazgos del estudio actual enfatizan la importancia de limitar los conservantes de alimentos y utilizar sólo el límite legal en la fabricación. Es posible que se requiera investigación adicional, que será beneficiosa para cambiar la percepción de la industria sobre los conservantes de alimentos como componentes seguros, lo que resultará en un uso más cauteloso. Se requieren encuestas de vigilancia más rigurosas del público y de las autoridades de seguridad alimentaria para utilizar estos productos químicos en la producción de alimentos.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

Fosfatasa alcalina

Alanina transaminasa

aspartato transaminasa

Ácido bórico

hidroxianisol butilado

catalasa

propionato de calcio

Glutatión reducido

malondialdehído

Factor nuclear potenciador de la cadena ligera kappa de células B activadas

Sorbato de potasio

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real.

Benzonato de sodio

Superóxido dismutasa

Receptores tipo peaje 2

Receptores tipo peaje 4

Factor de necrosis tumoral alfa

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Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco Egipcio de Conocimiento (EKB). Esta investigación fue financiada por la Universidad de El Cairo en un proyecto titulado "Evaluación de los riesgos de la coexposición a nanomateriales y contaminantes ambientales con estrategias de mitigación utilizando productos naturales" (proyectos de la Universidad de El Cairo-12-2021).

Departamento de Medicina Forense y Toxicología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Zagazig, Zagazig, 44519, Egipto

Yasmina M. Abd-Elhakim

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Zagazig, Zagazig, 44519, Egipto

amany behairy

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de El Cairo, Giza, 12613, Egipto

Mohamed MM Hashem y Khaled Abo-EL-Sooud

Departamento de Patología, Instituto de Investigación sobre Reproducción Animal, Giza, 3514805, Egipto

Abeer E. El-Metwally

Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, Future University, El Cairo, 11835, Egipto

Después de A. Hassan

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Zagazig, Zagazig, 44519, Egipto

Haytham A. Ali

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Jeddah, Jeddah, 23218, Arabia Saudita

Haytham A. Ali

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YMA recopiló las muestras, analizó los datos, preparó las figuras y revisó críticamente el manuscrito. AB realizó análisis de datos y redactó el manuscrito. MMMH diseñó experimentos y realizó la mayoría de los experimentos. KAE realizó análisis de datos y revisó críticamente el manuscrito. AEE realizó el estudio histopatológico y preparó las figuras. BAH realizó análisis de datos y revisó críticamente el manuscrito. HAA realizó el análisis de expresión génica. Todos los autores leyeron, revisaron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Yasmina M. Abd-Elhakim.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Abd-Elhakim, YM, Behairy, A., Hashem, MMM et al. Participación de los receptores tipo peaje y de la vía de señalización del factor nuclear kappa B en el daño oxidativo hepatorrenal inducido por algunos conservantes de alimentos en ratas. Informe científico 13, 5938 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32887-9

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Recibido: 21 de septiembre de 2022

Aceptado: 04 de abril de 2023

Publicado: 12 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32887-9

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