Noticias

Sep 29, 2023

Rápida reprogramación metabólica mediada por el AMP

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 422 (2023) Cite este artículo 2062 Accesos 17 Detalles de Altmetric Metrics El omnipresente patógeno Toxoplasma gondii tiene un estilo de vida complejo con

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 422 (2023) Citar este artículo

2062 Accesos

17 altmétrica

Detalles de métricas

El omnipresente patógeno Toxoplasma gondii tiene un estilo de vida complejo con diferentes actividades metabólicas en diferentes etapas que están íntimamente ligadas a los entornos parásitos. Aquí identificamos el regulador eucariota de la homeostasis celular, la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) en Toxoplasma y descubrimos su papel en la programación metabólica durante el ciclo lítico del parásito. La subunidad catalítica AMPKα se fosforila rápidamente después de la liberación de parásitos intracelulares a ambientes extracelulares, lo que impulsa el catabolismo productor de energía para impulsar la motilidad del parásito y la invasión de las células huésped. Una vez dentro de las células huésped, la fosforilación de AMPKα se reduce al nivel basal para promover un equilibrio entre la producción de energía y la síntesis de biomasa, lo que permite una replicación robusta del parásito. El agotamiento de AMPKγ suprime la fosforilación de AMPKα y suprime el crecimiento del parásito, que puede rescatarse parcialmente sobreexpresando AMPKα de tipo salvaje pero no los mutantes de fosforilación. Así, a través de la reprogramación cíclica por parte de AMPK, se satisfacen las necesidades metabólicas de los parásitos en cada etapa y el ciclo lítico progresa con fuerza.

Los cambios en las condiciones ambientales son desafíos a los que todos los organismos vivos deben enfrentarse. Debido a su estilo de vida único, los organismos parásitos son particularmente competentes en responder y adaptarse a los cambios ambientales. Toxoplasma gondii, un protozoo ubicuo que infecta a un tercio de la población humana y a numerosos animales del mundo, es capaz de crecer y sobrevivir en condiciones ambientales y de huésped extremadamente diversas1,2. Este parásito tiene un ciclo de vida complejo que alterna entre múltiples etapas que son claves para su patogénesis y transmisión. Durante la infección aguda de huéspedes intermediarios, los parásitos proliferan rápidamente como taquizoitos, que son responsables de los síntomas clínicos de la toxoplasmosis3. Los taquizoitos invaden activamente las células huésped, se replican en ellas y luego las lisan para iniciar nuevas invasiones cuando el número de parásitos alcanza una cierta cantidad. En condiciones óptimas, los parásitos crecen continuamente como taquizoítos y repiten el ciclo lítico. Sin embargo, en condiciones de estrés o inanición, los taquizoítos pueden convertirse en una forma menos activa llamada bradizoítos, que están encerrados en quistes tisulares y mantienen una infección crónica de por vida en los huéspedes1,2,4.

Los parásitos Toxoplasma tienen diferentes actividades metabólicas en diferentes etapas. La mayoría de las enzimas glucolíticas tienen dos isoformas, muchas de las cuales exhiben una expresión específica de etapa5,6, lo que indica distintos requisitos de actividad glucolítica en diferentes etapas. De manera similar, los bradizoítos y los ooquistes acumulan grandes cantidades de amilopectina, que apenas se observa en los taquizoítos7,8,9. La importancia fisiológica y los mecanismos reguladores subyacentes para dicho metabolismo específico de esta etapa se desconocen en gran medida. El ciclo lítico de los taquizoitos contiene dos etapas, una etapa extracelular corta cuando los parásitos recién salidos utilizan su motilidad de deslizamiento para encontrar e invadir las células huésped, y una etapa intracelular cuando los parásitos invadidos proliferan dentro de las células huésped. Desde el punto de vista metabólico, el objetivo principal de los taquizoitos extracelulares es generar suficiente energía para impulsar una invasión rápida y eficiente, mientras que los parásitos intracelulares necesitan una producción equilibrada de energía y síntesis de macromoléculas para replicarse. Se ha observado que la enzima glucolítica fructosa-bifosfato aldolasa se relocaliza desde el citoplasma a la periferia del parásito tan pronto como los parásitos se liberan de las células huésped10. Como el complejo motor que impulsa la motilidad del parásito se encuentra debajo de la membrana del parásito, se pensó que la relocalización de las enzimas glicolíticas era una forma de generar energía rápidamente en los lugares donde se necesita11. Además, al tratar los taquizoitos con glucosa marcada con 13C para controlar el flujo de carbono derivado de la glucosa, se ha demostrado que, aunque el 13C podría incorporarse eficientemente en macromoléculas como los ácidos grasos en los parásitos intracelulares, apenas se incorporó a dichas moléculas en los parásitos extracelulares12. Estas observaciones sugieren que, aunque la etapa extracelular es muy breve y dura de segundos a minutos, su metabolismo es fundamentalmente diferente al de los parásitos intracelulares. Se desconoce por completo cómo se regula y logra esa transición metabólica de corta duración.

Mantener la homeostasis metabólica en diferentes condiciones es clave para la vida de todos los organismos. En eucariotas, la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) es un regulador crucial del metabolismo celular que garantiza que las actividades metabólicas de una célula satisfagan sus necesidades13,14. AMPK es una serina/treonina quinasa conservada que consta de tres subunidades, una subunidad catalítica α y dos subunidades reguladoras β y γ. Supervisa el estado energético de una célula detectando la proporción de AMP a ATP y luego activa o desactiva los programas metabólicos de producción o consumo de energía en consecuencia15,16. AMPKγ contiene dominios de cistationina-β-sintasa (CBS) que se unen a AMP, lo que permite que el complejo AMPK responda a cambios en el nivel de energía17,18. La unión de AMP a AMPKγ induce la fosforilación de AMPKα en el residuo T172 (la numeración de residuos se basa en AMPKα de rata) y activa la actividad quinasa de AMPKα18,19. La regulación de la actividad de AMPK también requiere la subunidad β (AMPKβ), que funciona como un núcleo estructural para el complejo AMPK al interactuar con las subunidades α y γ, a través de su secuencia de unión a la subunidad αγ (αγ-SBS). Además, su módulo de unión a carbohidratos (CBM) y las modificaciones postraduccionales como la miristoilación y la fosforilación también desempeñan un papel para ajustar la actividad de AMPK20. Una vez activada, AMPK inicia una red de eventos de señalización que reprograman el metabolismo celular para preservar la energía. La AMPK puede fosforilar enzimas diana como la acetil-CoA carboxilasa para modular sus actividades13,14,19. La regulación transcripcional de la expresión del gen diana es otra forma en que AMPK regula el metabolismo y el crecimiento celular21. Se han identificado cientos de objetivos para AMPK, desde levaduras hasta humanos14,16,22. Dependiendo de las señales, AMPK ajusta las actividades de múltiples objetivos para lograr un programa metabólico concertado en respuesta a las fluctuaciones ambientales.

Las funciones reguladoras de la AMPK en el metabolismo y la homeostasis celular se estudian ampliamente en eucariotas modelo como Arabidopsis, levaduras y ratones. Sin embargo, rara vez se investigan sus funciones en organismos parásitos. Se han identificado complejos AMPK en Trypanosoma brucei y Trypanosoma cruzi23,24. En T. brucei, AMPKα1 se activa durante la diferenciación de la forma proliferativa en mamíferos a la forma inactiva preadaptada para el insecto vector. La estimulación o inhibición artificial de la activación de AMPKα1 afecta significativamente el proceso de transición, lo que sugiere un papel de AMPK en la regulación de los estilos de vida de este parásito23.

En este estudio, describimos el complejo AMPK en T. gondii e informamos su función esencial para la proliferación de parásitos. Toxoplasma codifica un único complejo canónico AMPK que consta de tres subunidades. La fosforilación de Toxoplasma AMPKα es baja en parásitos intracelulares pero se induce en gran medida en parásitos extracelulares, lo que lleva a la activación y desactivación cíclica de AMPK durante el ciclo lítico. Mediante la generación y caracterización de un mutante de agotamiento de AMPKγ que ha alterado la fosforilación de AMPKα, nuestros resultados revelan importantes funciones de reprogramación metabólica de AMPK durante el ciclo lítico de los taquizoítos.

El complejo canónico AMPK es un heterotrímero que consta de una subunidad α que es una quinasa activa y dos subunidades reguladoras β y γ que regulan la actividad de α22. Para identificar el complejo AMPK en T. gondii, se utilizaron subunidades de AMPK de levadura y humanos como cebos para realizar búsquedas BLASTP en la base de datos del genoma de Toxoplasma (TGGT1 de ToxoDB versión 42). Se identificaron dos proteínas con homologías significativas con la AMPKα humana y de levadura y se denominaron TgAMPKα (TGGT1_233905) y TgKIN (TGGT1_291050) respectivamente, que son candidatas a ortólogos de AMPKα en Toxoplasma. Análisis de secuencia adicionales indican que TgAMPKα tiene estructuras de dominio clásicas como otras proteínas AMPKα. Tiene un dominio quinasa conservado en el extremo N, seguido de un dominio autoinhibidor y motivos reguladores en la región C terminal (Fig. 1a). TgKIN también contiene un dominio quinasa. Sin embargo, tiene largas extensiones en las regiones terminales N y C que están mal conservadas (Fig. 1a), similares a las quinasas KIN en especies de Plasmodium que no parecen tener AMPKβ o AMPKγ. A juzgar por la estructura del dominio, TgAMPKα es probablemente el ortólogo auténtico de AMPKα en Toxoplasma, mientras que TgKIN es ortólogo de Plasmodium KIN y puede funcionar independientemente de las subunidades de AMPK (a continuación se describen más pruebas que respaldan esto). Las búsquedas BLAST de ToxoDB también identificaron proteínas que probablemente sean ortólogas a la AMPKβ humana y de levadura (TGGT1_268960, TgAMPKβ) y AMPKγ (TGGT1_239870, TgAMPKγ), pero en ambos casos la homología se limita a regiones cortas (Fig. 1b, c). El supuesto TgAMPKβ contiene un dominio CBM, que mostró un 46% de identidad de secuencia con el de AMPKβ1 humano (Fig. 1b). De manera similar, el supuesto TgAMPKγ contiene dos dominios CBS que se encuentran comúnmente en AMPKγ y tenían una identidad de secuencia del 21,7% y el 15,2% con el primer dominio CBS de AMPKγ2 humano respectivamente (Fig. 1c).

Estructuras de dominio a – c de las tres subunidades de Toxoplama AMPK en comparación con sus ortólogos correspondientes en otros eucariotas. Las proteínas humana (Homo sapiens, Hs), levadura (Saccharomyces cerevisiae, Sc) y Plasmodium (Pasmodium berghei, Pb) se incluyen a modo de comparación. En a. Las cepas transgénicas d que expresan TgAMPKα-Ty, TgAMPKβ-Ty o TgAMPKγ-HA se usaron individualmente en experimentos co-IP (usando anticuerpos contra las etiquetas de epítopo correspondientes) para identificar proteínas que interactúan con cada una de las subunidades de AMPK de Toxoplasma. Se mostraron los resultados seleccionados de estos experimentos co-IP identificados mediante espectrometría de masas (MS) y los números indican la cantidad de péptidos únicos derivados de los análisis de MS que coincidieron con los resultados correspondientes. Todos estos aciertos no se identificaron en los experimentos de control que involucraron cepas parentales no etiquetadas y se proporciona una lista completa de los aciertos en los datos complementarios 1. El reconocimiento de TgAMPKα por el anticuerpo monoclonal fosfo-AMPKα (Thr172) que reconoce HsAMPKα fosforilada, según lo determinado por Transferencia Western en parásitos extracelulares purificados (Toxoplasma) y células huésped. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para explorar más a fondo el complejo AMPK en Toxoplasma, se construyó una cepa transgénica marcada con Ty RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-Ty, en la que la AMPKα endógena se reemplazó con una AMPKα marcada con Ty expresada a partir de un promotor pTub (Fig. S1a-c). . Luego, esta cepa se usó en un experimento de coinmunoprecipitación (co-IP, usando el anticuerpo monoclonal Ty) y espectrometría de masas (MS) para buscar proteínas que interactúen con AMPKα. A juzgar por la cantidad de péptidos únicos de los resultados de la EM, el supuesto TgAMPKγ identificado a partir del análisis bioinformático fue el primer éxito de este co-IP/MS basado en AMPKα-Ty (Fig. 1d y tabla S1). No se encontraron péptidos de TgAMPKγ en el experimento de control utilizando la cepa parental RH sin etiquetar. De manera similar, el supuesto AMPKβ también estuvo entre los 10 primeros resultados (Fig. 1d y Tabla S1). Para confirmar aún más que estas proteínas forman un complejo, las supuestas subunidades AMPKβ y AMPKγ también se sometieron a análisis co-IP/MS. Las cepas RH Δhxgprt/LoxP-AMPKβ-Ty (que contenía una AMPKβ marcada con Ty, Fig. S2) y AMPKγ-mAID (que contenía una AMPKγ marcada con HA, que se describe a continuación) se utilizaron para este propósito en los experimentos co-IP. utilizando anticuerpos anti-Ty y -HA respectivamente. Cuando se analizaron los resultados de MS de estos experimentos co-IP, las supuestas subunidades de TgAMPK siempre aparecieron como los mejores resultados (Fig. 1d y tabla S1), lo que sugiere que son subunidades de AMPK genuinas que forman el complejo AMPK en T. gondii. Además, estos experimentos co-IP también identificaron posibles socios de unión del complejo Toxoplasma AMPK. En particular, es probable que las 63 proteínas que se enriquecieron en las tres co-IP basadas en subunidades de AMPK interactúen con AMPK (Fig. S3, Tabla S1 y datos complementarios 1). Por otro lado, ninguno de estos co-IP identificó a TgKIN como un éxito, lo que implica que TgKIN probablemente funciona por sí solo y no interactúa con ninguna de las supuestas subunidades de AMPK. En conjunto, nuestros datos sugieren que los taquizoitos de Toxoplasma tienen un complejo AMPK que consta de TgAMPKα, TgAMPKβ y TgAMPKγ.

La actividad del complejo AMPK está regulada por la fosforilación de un residuo de treonina específico (T172 para AMPK de mamíferos) en el bucle de activación de AMPKα. Debido a la alta similitud de secuencia en esta región (Fig. 1a), un anticuerpo monoclonal que reacciona con AMPKα humano fosforilado en treonina 172 también reconoció TgAMPKα fosforilada en parásitos extracelulares purificados (Fig. 1e). Para confirmar aún más que el producto del parásito reconocido por este anticuerpo es verdaderamente TgAMPKα, fusionamos un mini degrón inducible por auxina (mAID) al extremo carboxilo de la TgAMPKα endógena y construimos una cepa AMPKα-mAID, cuyo AMPKα podría agotarse después del indol-3-. tratamiento con ácido acético (IAA) (Fig. S4a). Como se esperaba, el producto reconocido por el anticuerpo anti-fosfo-AMPKα (Thr172) desapareció después de que los parásitos AMPKα-mAID fueron tratados con IAA (Fig. S4b), lo que demuestra que el producto del parásito reconocido es de hecho TgAMPKα.

Para evaluar las funciones fisiológicas de AMPK en Toxoplasma, primero introdujimos un plásmido que expresa la recombinasa Cre en la cepa RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-Ty descrita anteriormente. La recombinasa Cre indujo la escisión de AMPKα y activó la expresión de YFP, lo que informó la eliminación de AMPKα (Fig. S1c). Hemos intentado obtener un clon YFP+ AMPKα- limpio después de la transfección del plásmido que expresa Cre, pero fracasamos, lo que implica que AMPKα puede ser esencial para el crecimiento del parásito. Para respaldar aún más esta idea, la población de YFP+ en el grupo (RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-TY transfectada con Cre) alcanzó su punto máximo 2 días después de la introducción de Cre y luego disminuyó gradualmente y cayó a casi cero en el día 8 (Fig. S1d), lo que indica que Los mutantes AMPKα- tenían graves defectos de crecimiento, por lo que no podían competir con los parásitos AMPKα+ en el grupo. No obstante, es difícil utilizar este sistema para investigar el papel de TgAMPKα, ya que el porcentaje de parásitos YFP+ AMPKα- fue muy bajo (<10% incluso en el punto máximo) después de la transfección con Cre (Fig. S1d), lo que dificulta obtener suficientes parásitos AMPKα para el trabajo posterior. Mientras tanto, la cepa AMPKα-mAID mencionada anteriormente tampoco fue ideal para la evaluación funcional de AMPKα, porque el tratamiento con IAA redujo el crecimiento del parásito pero no lo detuvo como lo hicieron los parásitos YFP+ AMPKα- derivados del sistema loxP-AMPKα/Cre. Probablemente esto se deba al agotamiento incompleto de AMPKα por parte del IAA. Alternativamente, decidimos centrarnos en la subunidad γ y utilizamos enfoques genéticos para analizar sus funciones biológicas. En otros organismos modelo, AMPKγ detecta cambios en el metabolismo celular y es esencial para regular la actividad quinasa de AMPKα25,26. Como tal, AMPKγ es clave para la actividad del complejo AMPK y nos centramos en AMPKγ para evaluar el papel de AMPK en los parásitos Toxoplasma. Primero nos dirigimos a AMPKγ para la eliminación directa de genes, utilizando el reemplazo de genes homólogos asistido por CRISPR/Cas9. Sin embargo, la desactivación de este gen fracasó a pesar de haberlo intentado varias veces, lo que implica un papel crítico de AMPKγ para el crecimiento del parásito. Luego cambiamos a un enfoque de agotamiento condicional agregando un mAID al extremo carboxilo de AMPKγ en el locus del gen endógeno en la cepa RH ∆hxgprt Tir127 que expresa Tir1 (Fig. S5a). La cepa AMPKγ-mAID resultante se confirmó mediante PCR de diagnóstico (Fig. S5b) y la adición de IAA al medio de cultivo indujo una degradación eficiente de AMPKγ, detectada mediante ensayos de inmunofluorescencia (Fig. 2a) y transferencia Western (Fig. S5c). El agotamiento de AMPKγ suprimió el crecimiento del parásito, como lo demuestra la falta de formación de placas de los parásitos AMPKγ-mAID tratados con IAA en monocapas de HFF (Fig. 2b, c). Los análisis detallados sugirieron que el agotamiento de AMPKγ tenía un efecto global sobre el ciclo lítico de los parásitos. Las eficiencias de replicación intracelular (Fig. 2d), motilidad de deslizamiento (Fig. 2e) e invasión de la célula huésped (Fig. 2f) se redujeron después de la degradación de AMPKγ. El impacto del agotamiento de AMPKγ en estas actividades del parásito es probablemente indirecto, porque IAA podría inducir la degradación de AMPKγ en 30 minutos (Fig. 2a), sin embargo, los defectos de invasión no ocurrieron hasta 24 h después del tratamiento con IAA (Fig. 2f).

a Agotamiento de TgAMPKγ en la cepa AMPKγ-mAID mediante tratamiento con IAA, según lo determinado por IFA en parásitos intracelulares tratados con o sin IAA. El anticuerpo anti-HA se usó para sondear el nivel de AMPKγ y se usó TgALD como marcador citoplasmático. b Falta de crecimiento del parásito después del agotamiento de TgAMPKγ, según lo determinado mediante ensayos de placa con o sin tratamiento con IAA durante 7 días. c Tamaños relativos de las placas (expresados ​​como unidades de píxeles cuando se calculan con Adobe Photoshop) derivados de b. Se determinaron más de 90 placas para cada condición y los datos se representan gráficamente como gráficos de violín (mediana con rango intercuartil). ****P < 0,0001, NS (p = 0,1604): prueba t de Student de dos colas no significativa y no apareada. d Tasas de replicación intracelular de las cepas indicadas con o sin tratamiento con IAA, según lo determinado por la distribución de vacuolas parasitóforas (PV) que contienen 1, 2, 4, 8 o 16 parásitos después de 24 h de crecimiento intracelular. Medias ± SEM de n = 3 experimentos independientes, cada uno con dos réplicas técnicas, ANOVA de dos vías con post-pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. e La longitud de los senderos formados por parásitos extracelulares que se deslizan sobre la superficie recubierta de albúmina bovina. Los parásitos se trataron previamente con o sin IAA durante 48 h, se liberaron mecánicamente de las células huésped y se usaron para deslizarse sobre cubreobjetos precubiertos con albúmina bovina. Las huellas formadas por el deslizamiento del parásito se determinaron mediante IFA utilizando un anticuerpo contra la proteína de superficie SAG1. Se analizaron más de 150 senderos de planeo de n = 3 experimentos independientes (cada uno contenía de 49 a 67 senderos) para cada condición y se representaron gráficamente como gráficos de violín (mediana con rango intercuartil). ***P < 0,001, prueba t de Student de dos colas no apareada. f Eficiencias de invasión de la cepa AMPKγ-mAID pretratada con IAA durante 0, 12, 24, 48 o 72 h durante la etapa de crecimiento intracelular. Los parásitos pretratados se purificaron y se usaron para invadir células HFF durante 20 minutos y luego se usó un ensayo de tinción de dos colores para distinguir los parásitos invadidos de los no invadidos. La eficiencia de invasión de los parásitos no tratados (0 h) se estableció en 100% y se usó para normalizar la de los parásitos tratados con IAA. Medias ± DE de n = 3 experimentos independientes, ****P < 0,0001, prueba t de Student de dos colas no apareada, cada uno de ellos se comparó con el grupo de 0 h. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para confirmar aún más que los defectos de crecimiento del mutante AMPKγ-mAID tratado con IAA son causados ​​por la ausencia de AMPKγ, se construyó una cepa de complementación (Comp-γ) que expresa una AMPKγ etiquetada con Ty del locus UPRT de la cepa AMPKγ-mAID (Fig. S6a). Las PCR de diagnóstico confirmaron la correcta integración del constructo de complementación. La IFA y la transferencia Western aseguraron la expresión de AMPKγ complementaria (Fig. S6b-d). A diferencia de la cepa AMPKγ-mAID que no creció en presencia de IAA, la complementación de AMPKγ restableció completamente el crecimiento del parásito y el tratamiento con IAA no afectó la formación de placa de la cepa Comp-γ (Fig. S6e), lo que sugiere que la deficiencia de AMPKγ es de hecho responsable de la detención del crecimiento del mutante AMPKγ-mAID tratado con IAA.

La fosforilación del residuo T172 (o equivalente) es clave para regular la actividad de los complejos canónicos de AMPK. Dado que el agotamiento de TgAMPKγ es letal en los parásitos, intentamos determinar su impacto en la fosforilación de AMPKα. Cuando se examinaron parásitos extracelulares liberados mecánicamente mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo fosfo-AMPKα (Thr172), se encontró que la fosforilación de TgAMPKα en el residuo T221 (correspondiente a T172 de mamífero) estaba abolida después del agotamiento de AMPKγ, aunque el nivel de proteína de TgAMPKα no fue afectado (Fig. 3a). La reducción de la fosforilación de TgAMPKα se restableció completamente mediante la complementación de AMPKγ (Fig. S7), lo que confirma que TgAMPKγ es esencial para la fosforilación de TgAMPKα.

a La fosforilación de TgAMPKα se suprime en parásitos empobrecidos en TgAMPKγ. Los parásitos AMPKγ-mAID pretratados con o sin IAA durante 48 h se obligaron a salir de las células huésped y luego se analizaron mediante transferencias Western, utilizando anticuerpos que reconocían AMPKα fosforilado, TgAMPKα total o TgGRA1. b La fosforilación de TgAMPKα se induce en parásitos extracelulares en la cepa natural RH. Los parásitos intracelulares (PV intactos contenidos en las células huésped) o los parásitos liberados mecánicamente incubados en un ambiente extracelular durante 0 o 30 minutos se examinaron mediante transferencia Western. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para detectar condiciones que cambian el estado de fosforilación de TgAMPKα, se encontró que la liberación de parásitos intracelulares en ambientes extracelulares inducía la fosforilación de TgAMPKα. Cuando los parásitos intracelulares (las muestras contenían células huésped con vacuolas parasitóforas intactas) se sometieron a análisis de transferencia Western utilizando el anticuerpo fosfo-AMPKα (Thr172), apenas se pudo detectar la fosforilación de TgAMPKα. Por el contrario, cuando las células huésped infectadas se pasaron a través de una aguja de calibre 22 para lisar las células huésped y liberar los parásitos al medio de cultivo, la fosforilación de TgAMPKα se indujo rápida y dramáticamente (Fig. 3b). La incubación de los parásitos liberados mecánicamente en el entorno extracelular durante más tiempo obviamente no aumentó aún más la fosforilación de TgAMPKα. En conjunto, estos resultados sugieren que la liberación de parásitos de las células huésped a ambientes extracelulares es una señal fuerte para activar la fosforilación de TgAMPKα.

La disminución de la fosforilación de TgAMPKα tras el agotamiento de AMPKγ nos llevó a verificar si el cambio en la fosforilación de TgAMPKα era responsable de los defectos de crecimiento del mutante empobrecido en AMPKγ. Con este fin, introdujimos tres alelos diferentes de TgAMPKα que imitan diferentes estados de fosforilación en el mutante AMPKγ-mAID (Fig. 4a). El alelo T221D imita la fosforilación, mientras que el T221A tiene una fosforilación defectuosa. El alelo T221T de tipo salvaje se incluyó como control. Estos diferentes alelos de TgAMPKα se insertaron individualmente en el locus UPRT de la cepa AMPKγ-mAID y se expresaron en niveles similares (Fig. 4b). El impacto de estos alelos de AMPKα en el crecimiento de la cepa de agotamiento condicional de AMPKγ se estimó mediante ensayos de placa. Sin tratamiento con IAA, la expresión de TgAMPKα-T221D y TgAMPKα-T221A en AMPKγ-mAID redujo modestamente, pero significativamente, el crecimiento del parásito, como lo indican las placas más pequeñas (Fig. 4c, d). Por otro lado, la expresión de una segunda copia de TgAMPKα (el alelo T221T) no tuvo un impacto obvio (Fig. 4c, d). Cuando se usó IAA para inducir la degradación de AMPKγ, ni TgAMPKα-T221D ni TgAMPKα-T221A mejoraron el crecimiento de los mutantes empobrecidos en AMPKγ, ya que no se detectaron placas visibles incluso después de 15 días de crecimiento. Por otro lado, la expresión de TgAMPKα-T221T (TgAMPKα de tipo salvaje) permitió la formación de placas en presencia de IAA (Fig. 4c, d), lo que sugiere un rescate sólido de mutantes empobrecidos en AMPKγ por parte de TgAMPKα.

una ilustración esquemática de la expresión de los alelos TgAMPKα-T221T, -T221D o -T221A en parásitos que carecen de TgAMPKγ, que se logró mediante el tratamiento con IAA del mutante AMPKγ-mAID. El casete de expresión de AMPKα se insertó en el locus UPRT de la cepa AMPKγ-mAID para lograr expresiones similares para diferentes alelos de AMPKα. b Niveles de expresión de los alelos TgAMPKα-T221T/D/A en AMPKγ-mAID, determinados mediante transferencia Western contra la etiqueta Ty fusionada a TgAMPKα. Se incluyó TgALD como control de carga. c Ensayos de placa que evalúan el crecimiento global del mutante AMPKγ-mAID que expresa diferentes alelos de TgAMPKα, con o sin tratamiento con IAA durante 7 o 15 días. d Tamaños de placas derivados de c, expresados ​​en unidades de píxeles cuando se calculan con Adobe Photoshop. Medias ± DE de n ≥ 79 placas para cada condición. ****P < 0,0001, NS: prueba t de Student de dos colas no significativa y no apareada. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las diferentes capacidades de los alelos TgAMPKα para rescatar el crecimiento de mutantes empobrecidos en AMPKγ nos permitieron examinar cómo la fosforilación de AMPKα afecta las actividades del parásito. Los ensayos de placa descritos anteriormente evalúan la aptitud general de los parásitos. Los defectos en cualquier paso del ciclo lítico, como la invasión y la replicación, provocarían cambios en la formación de placa. Para examinar el impacto de la fosforilación de AMPKα en cada uno de estos pasos, primero verificamos la eficiencia de la replicación intracelular determinando la cantidad de parásitos en los PV. Sin tratamiento con IAA, la expresión de T221T o T221D de TgAMPKα tuvo poco efecto sobre la proliferación del parásito, mientras que T221A redujo ligeramente la proliferación (Fig. 5a). Cuando se trató con IAA para agotar AMPKγ, la expresión de TgAMPKα-T221T aumentó significativamente las tasas de replicación del parásito (en comparación con AMPKγ-mAID tratado con IAA), mientras que T221D o T221A no lo hicieron (Fig. 5a). La expresión del alelo T221A en realidad redujo la replicación de mutantes empobrecidos en AMPKγ (Fig. 5a). Por otro lado, cuando se probó la eficacia para invadir células huésped mediante un ensayo de invasión de 20 minutos, tanto los alelos T221T como T221D pudieron restaurar completamente los defectos de invasión de los mutantes empobrecidos en AMPKγ. El alelo T221A, por el contrario, redujo aún más la eficiencia de la invasión en lugar de mejorarla (Fig. 5b), lo que implica un efecto negativo dominante de este alelo. En conjunto, estos resultados demostraron que el alelo T221T de TgAMPKα restauró la invasión de la célula huésped y mejoró la tasa de replicación intracelular. Por lo tanto, pudo rescatar parcialmente el crecimiento de mutantes empobrecidos en AMPKγ. El alelo T221D restauró la invasión pero no la replicación, mientras que el T221A no hizo ninguna de las dos cosas, lo que explica su incapacidad para rescatar el crecimiento.

Todos los experimentos se repitieron n = 3 (a – c) o n = 4 (d) veces de forma independiente y se representan gráficamente las medias ± SEM. ***P = 0,0004, ****P < 0,0001, ANOVA bidireccional con pruebas posteriores de comparaciones múltiples de Tukey (a), prueba t de Student de dos colas no apareada (b-d). Los ensayos de replicación e invasión se realizaron como en las figuras 2d y f. El nivel de ATP se midió mediante un ensayo de luciferasa comercial utilizando lisados ​​preparados a partir de 5 × 106 parásitos frescos liberados mecánicamente que se trataron con o sin IAA durante 48 h. La actividad de síntesis de proteínas nacientes se determinó añadiendo L-homopropargilglicina, un análogo de metionina marcado con alquinos, a parásitos que fueron tratados con o sin IAA. Luego, la L-homopropargilglicina incorporada se detectó mediante un enfoque de química de clic utilizando la sonda fluorescente FAM azida y se cuantificó mediante análisis de citometría de flujo. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Una función clave del complejo AMPK es regular la homeostasis metabólica. Para comprobar el impacto del agotamiento de AMPKγ y la posterior expresión de los alelos TgAMPKα en el estado energético de los parásitos, se estimaron los niveles celulares de ATP utilizando un kit de ensayo de bioluminiscencia de ATP basado en luciferasa de luciérnaga. El tratamiento de los parásitos AMPKγ-mAID con IAA durante 48 h redujo el nivel de ATP en un 73,8% ± 1,8% (Fig. 5c). Además, la disminución del ATP celular se exacerbó a medida que aumentó el tiempo de tratamiento con IAA (Fig. S8), lo que sugiere que el drenaje de ATP después del agotamiento de AMPKγ es acumulativo en el tiempo. La expresión de la forma salvaje o mutante de TgAMPKα no alteró significativamente los niveles de ATP en ausencia de IAA. Con el tratamiento con IAA, el alelo T221D de TgAMPKα restableció significativamente el nivel de ATP celular, aunque no al nivel de los parásitos de tipo salvaje (Fig. 5c). La expresión de TgAMPKα-T221T también aumentó el nivel de ATP en mutantes de agotamiento de TgAMPKγ, pero el aumento no es estadísticamente significativo debido a la alta variación entre experimentos durante la cuantificación de ATP (Fig. 5c). Por el contrario, la expresión del alelo T221A redujo aún más el nivel de ATP, lo que coincide con un efecto negativo dominante de este mutante (Fig. 5c). Curiosamente, el efecto de diferentes alelos de TgAMPKα sobre los niveles celulares de ATP coincide bien con el de la eficiencia de invasión de las cepas correspondientes. Si bien se sabe que AMPK regula las actividades catabólicas y anabólicas para lograr la homeostasis energética, también evaluamos la actividad de síntesis de macromoléculas de los mutantes de agotamiento de TgAMPKγ, utilizando la síntesis de proteínas nacientes como ejemplo. Para este propósito se utilizó un enfoque de química de clic que detecta la incorporación de un análogo de metionina marcado con alquino (L-homopropargilglicina) en proteínas recién sintetizadas. El agotamiento de AMPKγ mediante el tratamiento con IAA de la cepa AMPKγ-mAID redujo la síntesis de proteínas nacientes en un 42,0% ± 8,7% (Fig. 5d). Curiosamente, la expresión de AMPKα-T221D resultó en una menor actividad de síntesis de proteínas incluso sin tratamiento con IAA, mientras que AMPKα-T221A o AMPKα-T221T no tuvieron tal efecto (Fig. 5d). En presencia de IAA, la expresión de AMPKα-T221D o AMPKα-T221A en la cepa AMPKγ-mAID no mejoró sus tasas de síntesis de proteínas (Fig. 5d). Por otro lado, la expresión de AMPKα-T221T aumentó la actividad de síntesis de proteínas al nivel similar en AMPKγ-mAID antes del tratamiento con IAA (Fig. 5d), aunque este aumento generalmente no se trató como estadísticamente significativo con un valor de p de 0,1039. Los diferentes efectos de los alelos de AMPKα sobre la producción de ATP y las actividades de síntesis de proteínas de los parásitos empobrecidos en AMPKγ sugieren que el estado de fosforilación de AMPKα tuvo un impacto significativo en el metabolismo del parásito.

Los resultados anteriores de estudios genéticos demostraron las funciones clave de la fosforilación de TgAMPKα en la regulación de las actividades y el metabolismo del parásito durante el ciclo lítico. Para examinar más a fondo el papel de AMPK, utilizamos un enfoque genético químico que implicó el uso de dos compuestos ampliamente utilizados para activar e inhibir AMPK respectivamente. Se usó A769662 como activador debido a su activación potente y directa de AMPK de mamíferos, mientras que el Compuesto C (diclorhidrato de dorsomorfina) se usó como inhibidor. Para descartar la posibilidad de que estos compuestos se dirigieran a la AMPK del huésped para afectar las actividades del parásito, utilizamos una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) cuya AMPKα1 y AMPKα2 estaban alteradas28. El tratamiento de parásitos de Toxoplasma intracelular con A769662 o el Compuesto C redujo su replicación en células MEF que carecen de AMPKα (Fig. 6a). El efecto inhibidor del Compuesto C fue significativamente más fuerte que el de A769662 y los parásitos tratados apenas se replicaron (Fig. 6a). Por otro lado, cuando se comparó la eficiencia de invasión de parásitos extracelulares, el tratamiento de los parásitos con A769662 durante 1 h aumentó la eficiencia de invasión de la célula huésped en un 46,8% ± 10,3%. Por el contrario, el tratamiento con el Compuesto C disminuyó la eficiencia de la invasión al 53,7% ± 19,8% de los que no recibieron tratamientos (Fig. 6b). Estos resultados son consistentes con los datos anteriores de estudios genéticos, lo que respalda aún más que la activación de AMPK aumenta la invasión de parásitos extracelulares y que la progresión del ciclo lítico requiere una activación dinámica de AMPK.

ensayos de replicación intracelular de RH en presencia de los tratamientos indicados, como se hace en la Fig. 2d. A los parásitos invadidos se les permitió replicarse durante 24 h en células MEF que carecían de AMPKα1 y AMPKα2. Medias ± SEM de n = 3 experimentos independientes, ****P < 0,0001, *P = 0,0201, ANOVA de dos vías con pruebas posteriores de comparaciones múltiples de Tukey. b eficiencia de la invasión de la célula huésped determinada mediante un ensayo de dos colores que discriminó parásitos invadidos y no invadidos. Los parásitos RH se trataron con los productos químicos indicados durante 1 h antes de su salida. Luego se liberaron mediante pase con aguja y se usaron parásitos purificados para infectar células HFF durante 10 minutos en presencia de los compuestos correspondientes. Posteriormente se determinó mediante IFA el número de parásitos invadidos. La eficiencia de la invasión se representó como el número de parásitos invadidos dividido por el número de células huésped. Medias ± DE de n = 3 experimentos independientes, *P = 0,0103, **P = 0,0015, prueba t de Student de dos colas no apareada. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La regulación transcripcional y la modificación postraduccional de objetivos son dos estrategias comunes aplicadas por AMPK para regular las actividades celulares. Para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al crecimiento deficiente y al metabolismo alterado de los mutantes empobrecidos en AMPKγ, primero verificamos los cambios en la expresión genética de los parásitos tras el agotamiento de AMPKγ. Los análisis de RNA-seq demostraron que el agotamiento de AMPKγ tuvo un efecto menor en la expresión del gen del parásito. Solo 61 genes cumplieron con nuestros criterios de llamada de genes expresados ​​diferencialmente, entre los cuales 40 genes estaban regulados positivamente y 21 estaban regulados negativamente en el mutante de agotamiento de AMPKγ (Fig. S9, Datos complementarios 2).

El agotamiento de AMPKγ conduce a una reducción dramática de la fosforilación de AMPKα, que es clave para la actividad quinasa de AMPK. Como tal, buscamos determinar la alteración de la fosforilación de proteínas en parásitos tras el agotamiento de AMPKγ. Los parásitos extracelulares de la cepa AMPKγ-mAID pretratados con o sin IAA durante 48 h se sometieron a análisis proteómicos y fosfoproteómicos respectivamente, para evaluar los cambios en la abundancia de proteínas y el estado de fosforilación de proteínas individuales. La proteómica cuantitativa identificó 47 proteínas cuya abundancia se alteró> 1,5 veces (p <0,05), 24 de las cuales disminuyeron y 23 aumentaron después del agotamiento de AMPKγ (Fig. S10, Datos complementarios 3). Por otro lado, la abundancia de 325 fosfopéptidos tuvo un cambio de abundancia de más de 1,5 veces después del agotamiento de AMPKγ. Después de los ajustes con los cambios en el nivel de proteína (para descartar que el cambio en la abundancia de fosfopéptidos fuera causado por cambios en el nivel de proteína), la abundancia de 285 fosfopéptidos correspondientes a 170 proteínas cambió >1,5 veces (p < 0,05) con AMPKγ. agotamiento (Datos complementarios 4). Más del 40% (74/170 = 43,5%) de estas proteínas son proteínas hipotéticas con funciones desconocidas. Además de eso, una gran cantidad de proteínas con funciones metabólicas, incluidas enzimas, transportadores y reguladores, se fosforilaron diferencialmente en los parásitos AMPKγ+ versus AMPKγ-. En particular, las enzimas glicolíticas piruvato quinasa 1 (PYK1) y fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa (ALD), así como el principal importador de glucosa, el transportador de glucosa 1 (GT1), contenían dos o más fosfopéptidos que tenían una gran diferencia entre Parásitos agotados y que expresan AMPKγ (Fig. 7a). Otras proteínas involucradas en la degradación del azúcar o el metabolismo energético, incluida la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGD), la acetil-coenzima A sintetasa (ACS) y la piruvato deshidrogenasa quinasa también mostraron cambios en la fosforilación en residuos de serina específicos tras la degradación de AMPKγ (Fig. 7a, Datos complementarios 4). De manera similar, varias proteínas y enzimas involucradas en el anabolismo, como la síntesis de lípidos y proteínas, también mostraron cambios de fosforilación después del agotamiento de AMPKγ (Fig. 7b, Datos complementarios 4). En particular, la fosforilación de tres factores de iniciación eucariotas (eIF2B, eIF4A y eIF4G) que controlan el inicio de la traducción de proteínas se redujo tras la degradación de AMPKγ (Fig. 7b), lo que es consistente con la alteración de la síntesis de proteínas nacientes de los parásitos empobrecidos en AMPKγ (Fig. 5d).

Alteración de la fosforilación de proteínas seleccionadas del catabolismo del azúcar (a) y proteínas de síntesis de biomasa (b) en las posiciones indicadas después de la degradación de TgAMPKγ, según lo determinado por fosfoproteómica en parásitos AMPKγ-mAID liberados con aguja pretratados con o sin IAA durante 48 h. Las proteínas de parásitos extraídas de n = 3 conjuntos de muestras independientes (cada conjunto contenía una muestra para parásitos tratados con IAA y otra para parásitos no tratados) se digirieron con tripsina y se marcaron con seis etiquetas de masa en tándem plex (TMT). Luego, los fosfopéptidos se enriquecieron con TiO2 e IMAC y se cuantificaron mediante LC-MS/MS. El cambio de abundancia (expresado como cambio de log2 veces) y el valor p correspondiente (determinado por pruebas empíricas de Bayes de dos colas en el paquete limma) (expresado como valor p -Lg) de cada fosfopéptido después del agotamiento de TgAMPKγ (+IAA /-IAA) fueron trazadas. Cada condición se probó n = 3 veces de forma independiente. GT1 transportador de glucosa 1, ACS acetil-coenzima A sintetasa, ALD fructosa-1,6-bifosfato aldolasa, PYK1 piruvato quinasa 1, PDK piruvato deshidrogenasa quinasa, 6PGD 6-fosfogluconato deshidrogenasa, eIF factor de iniciación eucariótico, CEPT colina/etanolamina fosfotransferasa, FAAL Acil graso-AMP ligasa.

La AMPK, como sensor de energía y regulador clave del metabolismo, está ampliamente presente en casi todos los eucariotas y ha sido ampliamente estudiada en organismos modelo como levaduras y células humanas13,16. Sin embargo, se sabe poco sobre sus funciones en organismos parásitos, que tienen estilos de vida únicos que requieren una regulación elaborada. Aquí hemos identificado un complejo AMPK en el parásito intracelular obligado Toxoplasma gondii, que es un modelo para estudiar la compleja biología de los parásitos apicomplejos. Centrándonos en la subunidad γ del complejo AMPK de Toxoplasma, informamos que una AMPK intacta es esencial para el crecimiento de este parásito. El agotamiento condicional de TgAMPKγ resultó en una reducción de la motilidad, invasión y replicación intracelular del parásito (Fig. 2). Más importante aún, se descubrió que la fosforilación de TgAMPKα en el residuo T221 (por lo tanto, la activación del complejo AMPK) se inducía en gran medida cuando los parásitos salían de las células huésped y se liberaban al entorno extracelular. El agotamiento de TgAMPKγ eliminó la fosforilación de TgAMPKα (Fig. 3). Al sobreexpresar los alelos de TgAMPKα que imitaban diferentes estados de fosforilación en el mutante de agotamiento de TgAMPKγ, nuestros resultados sugieren un papel crítico de AMPK en la reprogramación de las actividades metabólicas del parásito durante el ciclo lítico de Toxoplasma. Cuando los taquizoítos salen de las células huésped, la TgAMPKα se fosforila y activa para impulsar el catabolismo y suprimir el anabolismo, lo que permite a los parásitos maximizar la producción de ATP para una motilidad e invasión eficientes. Porque en la fase extracelular la síntesis de biomasa es limitada y la tarea más importante es encontrar células huésped adecuadas e invadirlas, lo que requiere mucha energía. Después de una invasión exitosa y cuando los parásitos son intracelulares, el objetivo principal es replicarse. Como tal, la fosforilación de TgAMPKα se reduce al nivel basal y el metabolismo sesgado de producción de energía en los parásitos extracelulares cambia a un metabolismo más equilibrado de generación de energía y síntesis de biomasa, lo que permite que los parásitos proliferen de manera eficiente (Fig. 8). De acuerdo con este modelo, si bien tanto el inhibidor como el activador de AMPK redujeron la replicación del parásito, sus impactos sobre la invasión fueron diferentes. El activador aumentó la eficiencia de la invasión, mientras que el inhibidor la disminuyó (Fig. 6).

La liberación de parásitos intracelulares al ambiente extracelular induce la fosforilación de AMPKα, que activa el catabolismo para generar energía y suprime el anabolismo. En la etapa extracelular, la actividad de síntesis de biomasa es baja, pero los parásitos necesitan mucha energía para impulsar la motilidad y poder invadir eficientemente las células huésped. Una vez internalizado en las células huésped, la fosforilación de AMPKα se reduce y se logra un equilibrio entre el catabolismo productor de energía y el anabolismo sintetizador de biomasa, lo que permite una proliferación robusta de los parásitos.

Nuestros resultados sugieren que sólo hay un complejo AMPK en Toxoplasma y cada subunidad está codificada por un gen. Esto es diferente de otros organismos como las levaduras y los humanos16,22. Las levaduras tienen una subunidad α Snf1, una subunidad γ Snf4 y tres subunidades β (Sip1, Sip2 y Gal83). Los humanos, por otro lado, tenemos dos subunidades α (α1 y α2), dos subunidades β (β1 y β2) y tres subunidades γ (γ1, γ2 y γ3). Estas subunidades pueden formar diferentes combinaciones heterotriméricas para generar diferentes complejos AMPK, que pueden tener diferente distribución tisular, localización subcelular y funciones22. En otros organismos modelo, la AMPK no parece ser esencial a nivel celular en condiciones de crecimiento estándar, aunque su inactivación podría provocar letalidad embrionaria o detención del desarrollo29,30. Por el contrario, AMPK es esencial en T. gondii, como lo demuestran los graves defectos de crecimiento del mutante de agotamiento de AMPKγ y del mutante de deleción de AMPKα (Fig. 2 y Fig. S1). Esto resalta las diferencias de la función de AMPK entre los parásitos Toxoplasma y otros organismos. Entre los eucariotas cuyos genomas han sido secuenciados, la gran mayoría tiene genes que codifican AMPK. Sin embargo, hay algunas excepciones y los parásitos de la malaria en humanos y roedores como Plasmodium falciparum y Plasmodium berghei son ejemplos. Por otro lado, las especies de Plasmodium codifican una quinasa llamada KIN que tiene una similitud de secuencia limitada con AMPKα31. El mutante fosfomimético de KIN es capaz de rescatar el mutante de deleción Snf1 en la levadura, lo que indica una conservación funcional de estas proteínas. Además, aunque los parásitos de la malaria no parecen tener AMPKβ o AMPKγ canónicos, sí responden al salicilato que se une a AMPKβ y promueve la fosforilación de AMPKα, lo que sugiere que pueden tener subunidades crípticas de AMPK que son divergentes de las AMPK canónicas31. Toxoplasma también codifica un KIN que es muy similar al Plasmodium KIN y su función aún no se ha dilucidado. La puntuación del fenotipo (derivada de una prueba CRISPR de todo el genoma que estimó el costo de aptitud de inactivar un gen determinado) para TgKIN (0,04) implica que probablemente no sea necesario para el crecimiento del parásito en condiciones estándar32, similar a KIN en Plasmodium sp.

Durante el ciclo lítico de los taquizoitos de Toxoplasma, la fosforilación de AMPKα en el residuo T221 aumenta considerablemente justo después de que los parásitos se liberan de las células huésped. Sin embargo, actualmente se desconocen las señales exactas que desencadenan la fosforilación, así como las quinasas que median en la fosforilación. En las células de mamíferos, una variedad de condiciones que agotan la energía celular (caída de ATP y aumento de AMP o ADP) o el nivel de glucosa dan como resultado la fosforilación y activación de AMPKα13,16,22. LKB1 es la principal quinasa responsable de la activación de AMPKα en estas condiciones33,34. Además, la AMPK también puede ser activada por la proteína quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina (CaMKK) en respuesta al aumento de Ca2+ celular 35,36. Mediante copurificación con subunidades de SNF1, también se identificaron quinasas que activan el SNF1 de levadura37. Tanto en levaduras como en células de mamíferos, múltiples quinasas participan en la activación de AMPK, pero la homología entre esas quinasas se limita en gran medida a los dominios catalíticos. Sin embargo, las quinasas SNF1 de levadura como Tos3p pueden fosforilar la AMPK37 de los mamíferos. Asimismo, LKB1 y CaMKK pueden funcionar en levaduras como enzimas activadoras de Snf135,37. Estos resultados sugieren una conservación funcional de las quinasas que fosforilan AMPK de diferentes especies. Sin embargo, los análisis de secuencia sugirieron que ninguna de las quinasas que fosforilan AMPKα en humanos o levaduras parece tener ortólogos en Toxoplasma. Por otro lado, dado que la fosforilación de TgAMPKα se induce después de que los parásitos salen de las células huésped, es razonable predecir que las CDPK y las AGC quinasas (familias de proteínas quinasas A, G y C) pueden estar involucradas en la fosforilación de TgAMPKα27. 38,39,40. En apoyo, algunas de estas quinasas, incluidas CDPK6, CDPK2A, PKG, CDPK1 y CDPK3, se identificaron como posibles socios de interacción de AMPK en los experimentos co-IP (datos complementarios 1). Sin embargo, todas estas posibilidades requieren más investigaciones para su confirmación. También cabe mencionar que puede haber más de una quinasa para activar TgAMPKα. Los parásitos T. gondii tienen un ciclo de vida complejo. TgAMPK puede detectar diferentes señales en diferentes etapas de desarrollo y regular diferentes actividades celulares. Descubrimos que en los taquizoitos, la liberación de parásitos al ambiente extracelular va acompañada de la activación de TgAMPK. Sin embargo, actualmente se desconoce la señal desencadenante exacta. Hemos probado algunas posibilidades, como el cambio de las concentraciones de Na+ y K+ que imitan las condiciones del buffer intracelular y extracelular, cambios en el nivel de Ca2+ (mediante el uso del ionóforo de calcio A23187 o el quelante BAPTA-AM). Pero ninguno de estos pareció tener un fuerte impacto en la activación de TgAMPK inducida por la salida. Por lo tanto, es necesario seguir trabajando para determinar la señal exacta que activa TgAMPK en esta configuración.

Además de la activación por fosforilación, la localización subcelular también juega un papel clave en la regulación de la actividad de AMPK. En eucariotas superiores, AMPK se desplaza entre el núcleo y el citoplasma de una manera dependiente de Ran GTPasa y dicho desplazamiento puede ser modulado por tensiones41. Nuestros resultados mostraron que la fosforilación y activación de Toxoplasma AMPK aumentó drásticamente tras la liberación de parásitos intracelulares a ambientes extracelulares. Como tal, también probamos la localización subcelular de las subunidades de TgAMPK en estas dos condiciones. Utilizando las cepas AMPKα-mAID y AMPKγ-mAID que contenían una etiqueta HA en los extremos C de AMPKα o AMPKγ endógenos, los análisis IFA mostraron que tanto AMPKα como AMPKγ estaban en gran medida en el citoplasma de los parásitos intracelulares. Sin embargo, en los parásitos extracelulares liberados mecánicamente, se pudieron observar AMPKα y AMPKγ nucleares en el 50% y el 85% de los parásitos, respectivamente (Fig. S11), lo que sugiere que el transporte nucleocitoplasmático de AMPK puede ser otro mecanismo para regular la actividad de AMPK durante el ciclo lítico. de taquizoítos. De acuerdo con esta observación, nuestros experimentos co-IP identificaron proteínas involucradas en el transporte nuclear como posibles socios de unión de AMPK. En particular, TGGT1_243960 y TGGT1_222380 se identificaron en las tres co-IP basadas en subunidades de TgAMPK (tabla S1). TGGT1_243960 contiene un dominio del factor de transporte nuclear 2 (NTF2) que se conserva en las proteínas de unión a Ran (proteína nuclear relacionada con Ras), que participan en el transporte de macromoléculas entre el citoplasma y el núcleo, así como en el transporte nucleocitoplásmico de AMPK. TGGT1_222380 es un ortólogo de la exportina 7 de mamíferos y se sabe que las exportinas median la exportación nuclear de AMPK en eucariotas superiores. Si estas dos proteínas están involucradas en el transporte nucleocitoplasmático de AMPK en los parásitos Toxoplasma y la importancia fisiológica de dicho transporte son cuestiones abiertas que se abordarán en el futuro. Además, los complejos que contienen AMPK también se encuentran en otros orgánulos como los lisosomas, las mitocondrias y el retículo endoplásmico en los eucariotas superiores26. El complejo lisosomal que contiene aldolasa, v-ATPasa, Ragulator, axina y LKB1 activa AMPK durante la falta de glucosa antes de que se produzca una disminución de ATP42. Se requieren tensiones metabólicas más graves para activar las reservas citosólicas y mitocondriales de AMPK26. Nuestros resultados de localización mostraron que Toxoplasma AMPK se encuentra principalmente en el citoplasma, pero no se puede excluir la posibilidad de localización en otros orgánulos. En particular, aunque Toxoplasma no parece codificar Ragulator y axina, también se encontró que la fructosa-1 6-bifosfato aldolasa (ALD), que media la detección de glucosa por el complejo lisosomal AMPK, es un posible socio de interacción de TgAMPK (Datos complementarios 1 ). Queda por determinar si el parásito ALD forma un complejo con AMPK y tiene una función de detección de glucosa similar.

En otros organismos modelo, AMPK regula una amplia variedad de objetivos para controlar la homeostasis celular, mediante enfoques de modificación transcripcional y postraduccional. La lista de objetivos de AMPK sigue creciendo43. A partir de nuestros resultados de sobreexpresación de diferentes alelos de TgAMPKα en el mutante de agotamiento de TgAMPKγ, está claro que el estado de fosforilación de TgAMPKα en la posición T221 tiene impactos significativos sobre el anabolismo y el catabolismo. Pero los mecanismos subyacentes son en gran medida desconocidos. Tampoco está claro si la TgAMPKα sobreexpresada en ausencia de TgAMPKγ utilizó el mismo mecanismo para regular el metabolismo y las actividades del parásito que la TgAMPKα nativa (como la de los parásitos de tipo salvaje) en presencia de TgAMPKγ, porque en otros organismos modelo, la activación y Las actividades posteriores de AMPK pueden modularse de manera diferente según los diferentes grados y tipos de estrés o fluctuaciones metabólicas44. No obstante, el agotamiento de TgAMPKγ conduce a una detención del crecimiento, pero no parece causar una alteración dramática en la transcripción genética. Por otro lado, suprime la fosforilación de TgAMPKα. En nuestro análisis fosfoproteómico, la abundancia de 285 fosfopéptidos únicos, correspondientes a 170 proteínas, cambió significativamente (P <0,05, cambio de veces> 1,5) después del agotamiento de TgAMPKγ. Estos incluyen muchas enzimas y reguladores metabólicos, como la piruvato quinasa 1, la fructosa-1,6-bifosfato aldolasa, el transportador de glucosa GT1 y la piruvato deshidrogenasa quinasa que participan en la degradación del azúcar y la producción de ATP45,46,47, así como una serie de factores de iniciación eucariotas y CDP-alcohol fosfatidiltransferasa que intervienen en la síntesis de proteínas y fosfolípidos. Muchas de estas proteínas también fueron identificadas en los experimentos co-IP como posibles proteínas de interacción con AMPK. Estas proteínas son posibles objetivos de AMPK en Toxoplasma. Se necesitan más estudios para analizar cómo exactamente están regulados por AMPK y el significado fisiológico de dicha regulación. Por otro lado, cuando algunas de las proteínas fosforiladas diferencialmente enumeradas en la Fig. 7 (como GT1, ALD, PYK1 y ACS) se analizaron en detalle para ver si los residuos potencialmente fosforilados por TgAMPK se conservaban entre otros organismos. Curiosamente, si bien los ortólogos de estas proteínas están presentes en eucariotas modelo, desde levaduras hasta moscas de la fruta y humanos, los residuos fosforilados dentro de ellos no se conservan o no tienen evidencia de fosforilación dependiente de AMPK. Estos resultados sugieren que las proteínas analizadas no son sustratos directos de TgAMPKα, sino otras quinasas cuyas actividades están influenciadas por TgAMPKα, o que los mecanismos detallados por los cuales Toxoplasma AMPK regula el metabolismo del parásito son diferentes de los de otros eucariotas.

Los taquizoitos de las cepas RH Δhxgprt3 y RH ∆hxgprt Tir127 y sus derivados se propagaron en fibroblastos de prepucio humano (ATCC, EE. UU.), que se cultivaron en medio Eagles modificado de Dulbeccos (DMEM) (Sigma-Aldrich, EE. UU.) suplementado con 2% de fetos bovinos. suero (FBS) (Gibco, EE. UU.), glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina al 1%. Todas las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla S2 de la información complementaria. A menos que se indique lo contrario, los parásitos se obligaron a salir de las células huésped mediante el paso secuencial de una jeringa a través de agujas de calibre 22 y se filtraron mediante filtración a través de membranas de policarbonato de 3 µm (Whatman, EE. UU.) antes de su uso.

Para identificar ortólogos del complejo AMPK en Toxoplasma, se utilizaron secuencias de AMPK humana (α2, β1 y γ2) y SNF1 de levadura (Saccharomyces cerevisiae Snf1, Gal83 y Snf4) como secuencias de consulta para realizar búsquedas BLAST de proteínas contra el genoma de Toxoplasma en ToxoDB (www. .toxodb.org). Para identificar TgAMPKα, se utilizaron coincidencias de Toxoplasma de AMPKα2 humano y búsquedas BLAST basadas en Snf1 de levadura con un valor E inferior a 1e-50 como secuencias de consulta para BLAST contra los genomas humano y Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. Solo los resultados que identificaron a la AMPKα humana y a la levadura Snf1 como la principal coincidencia en las búsquedas recíprocas de BLAST fueron aceptados como supuestas subunidades de AMPKα en Toxoplasma. Se utilizó un enfoque similar para identificar TgAMPKβ y TgAMPKγ, excepto que los resultados originales (realizados en ToxoDB utilizando β1, γ2 humanos y levadura Gal83, Snf4 como cebos) con valores de E inferiores a 0,001 se sometieron a búsquedas BLAST recíprocas en humanos y levaduras.

Todos los plásmidos utilizados en este estudio, así como los métodos para su construcción, se enumeran en la Tabla S3 de la Información complementaria. Todos los cebadores utilizados fueron sintetizados por un proveedor comercial (Tsingke Biotechnology Co., Ltd, Beijing, China) y se enumeran en la Tabla S4. Todos los plásmidos se construyeron mediante clonación de múltiples fragmentos utilizando el kit de clonación ClonExpress MultiS (Vazyme Biotech, China), excepto los plásmidos CRISPR específicos del locus, que se generaron reemplazando la secuencia de ARNg dirigida a UPRT en pSAG1-Cas9-U6-sgUPRT con locus- secuencias guía específicas, siguiendo protocolos previamente descritos48. Todas las cepas transgénicas se construyeron mediante edición de genes específica del sitio mediada por CRISPR/Cas949. La cepa AMPKγ-mAID se construyó mediante electroporación conjunta del plásmido pSAG1::Cas9-U6::sg-AMPKγ-3UTR y el AMPKγ-mAID~HXGPRT. fragmento derivado del plásmido pUC19-AMPKγ-mAID~HXGPRT en taquizoitos purificados de la cepa RH ∆hxgprt Tir1. Los transfectantes se seleccionaron con 25 µg/ml de ácido micofenólico (MPA) y 50 µg/ml de xantina (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se clonaron de forma única mediante dilución limitante. Los clones individuales se examinaron mediante PCR de diagnóstico (los cebadores se enumeran en la Tabla S4) y ensayos de inmunofluorescencia (que detectan la presencia de la etiqueta HA). Posteriormente, se usó una concentración final de ácido indol-3-acético (IAA) 500 µM (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para inducir la degradación de AMPKγ en la cepa AMPKγ-mAID. La cepa AMPKα-mAID se construyó de la misma manera. La cepa de complementación de AMPKγ Comp-γ, así como las cepas que expresan AMPKα-T221T, -T221D o -T221A se construyeron cotransfectando los casetes que expresan AMPKγ o AMPKα y la UPRT dirigida a pSAG1‐Cas9‐sgUPRT en taquizoítos de AMPKγ. -cepa mAID. Los transfectantes se seleccionaron con 5-fluoro-2'-desoxiruridina (FUDR) 10 µM (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y pirimetamina 1 µM (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y los clones individuales se examinaron mediante PCR de diagnóstico e IFA antes de su uso. La cepa RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-TY se construyó cotransfectando pSAG1:Cas9-sgAMPKα y el fragmento que contiene Loxp-AMPKα-TY amplificado a partir de pTUB1-Loxp-AMPKα-TY-LoxP-YFP-DHFR en la cepa RH Δhxgprt y seleccionado con pirimetamina 1 µM. Los transfectantes resistentes a fármacos se clonaron individualmente mediante dilución limitante. La cepa RH Δhxgprt/LoxP-AMPKβ-TY se generó de forma muy similar. En ambos casos, los clones individuales se examinaron mediante PCR de diagnóstico e IFA antes de su uso.

Taquizoitos frescos de las cepas transgénicas RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-TY, RH Δhxgprt/LoxP-AMPKβ-TY o AMPKγ-mAID, así como las cepas parentales correspondientes (RH Δhxgprt para AMPKα y AMPKβ, RH ∆hxgprt Tir1 para AMPKγ) que se usaron como controles, se liberaron con aguja de las células huésped y se purificaron mediante filtración a través de membranas de policarbonato de 3 µm. Luego se recogieron 5 × 108 parásitos de cada cepa, se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo y se lisaron con 400 µl de tampón de lisis Western e IP (Beyotime, Shanghai, China) que contenía fluoruro de fenilmetilsulfonilo. Durante la lisis, las muestras se colocaron en un sonicador al baño maría y se sonicaron durante 30 minutos en agua helada. Luego, los lisados ​​​​se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos y los sobrenadantes se recogieron para experimentos co-IP posteriores. Para hacer co-IP, los sobrenadantes de los lisados ​​de parásitos se eliminaron mediante incubación con perlas de agarosa AG de proteína conjugada con IgG de ratón (Beyotime, Shanghai, China) a 4 °C durante 2 h, para eliminar las proteínas que se unen a perlas de agarosa o IgG de ratón. . Luego, los sobrenadantes eliminados se agregaron a perlas de agarosa de proteína AG conjugadas con anticuerpos anti-Ty de ratón o anticuerpos anti-HA de ratón (Medical & Biological Laboratory CO., LTD, Tokio, Japón) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Posteriormente, las perlas se sedimentaron mediante centrifugación a 1000 g durante 2 minutos y se lavaron con PBS enfriado con hielo tres veces para eliminar las proteínas no unidas. Finalmente, las proteínas unidas se sometieron a digestión con tripsina en perlas y luego se identificaron mediante espectrometría de masas, siguiendo los métodos de identificación de proteínas que se describen a continuación en las secciones LC-MS/MS y análisis de datos.

Los IFA y Western Blots que examinaron la expresión de proteínas se realizaron de acuerdo con protocolos establecidos45,48. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: aldolasa anti-Toxoplasma de conejo (dilución 1:5000 para WB y 1:2000 para IFA), etiqueta anti-Ty de ratón (el clon BB2 de anti-Ty1, proporcionado por el Prof. David Sibley, Universidad de Washington en St. Louis, EE. UU.) (1:2000 para WB y 1:1000 para IFA), etiqueta anti HA de ratón (el clon TANA2 de anti-HA, MBL International Corporation, Japón) (1:1000 para WB y 1:300 para IFA) , ratón anti Toxoplasma SAG1 (proporcionado por el Prof. David Sibley, Universidad de Washington en St. Louis, EE. UU.) (1:2000 para IFA), ratón anti Toxoplasma GRA1 (1:5000 para WB), conejo anti Toxoplasma AMPKα (producido mediante inmunización conejos con un péptido derivado de AMPKα (GSPKDPSRSPGRSE) conjugado con hemocianina de lapa californiana) (1:1000 para WB), conejo anti fosfo-AMPKα(Thr172) (Beyotime, China) (1:500 para WB), IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (1:5000 para WB), IRDye 800CW IgG de cabra anti-ratón (LI-COR Biosciences. EE. UU.) (1:5000 para WB), IgG de cabra anti-conejo marcada con HRP (Beyotime Biotechnology, China) (1:1000 para WB), IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa Fluor 488 (1:2000 para IFA), IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa Fluor 488 (1:2000 para IFA), IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa Fluor 488 (1: 2000 para IFA) y IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa Fluor 594 (1:2000 para IFA) (Fisher Scientific. EE.UU). Las imágenes IFA fueron adquiridas por un microscopio Olympus BX53 (Olympus Life Science, Japón) equipado con una cámara mono Axiocam 503 (Carl Zeiss Inc., Alemania) y un software ZEN 2 (edición azul) (Carl Zeiss Inc., Alemania). Las transferencias Western se escanearon con un generador de imágenes Amersham Typhoon 5 (GE Healthcare, Reino Unido). En el archivo de datos de origen, así como en la información complementaria, se proporcionaron imágenes de transferencia IFA y Western sin recortar y sin procesar.

Ensayos de placa que estiman el crecimiento general de parásitos en monocapas de HFF, ensayo de invasión de dos colores que determina la eficiencia de invasión del parásito en células HFF, ensayo de motilidad que examina el deslizamiento de parásitos purificados en cubreobjetos recubiertos con BSA, así como el ensayo de replicación intracelular que determinan la eficiencia de la proliferación en células HFF se realizaron siguiendo los protocolos descritos previamente45,48,50. Todos los ensayos se repitieron de forma independiente dos o tres veces, cada uno con tres réplicas biológicas. Para probar el impacto del inhibidor y activador de AMPK en la invasión de parásitos, se utilizaron A769662 20 μM (activador) (Macklin Inc., Shanghai, China) o compuesto C 5 μM (inhibidor) (MedChemExpress LLC, Shanghai, China) para tratar los parásitos RH. durante 1 h antes de la salida. Luego, los parásitos se liberaron mediante pase con aguja, se purificaron mediante filtración y se usaron para infectar células HFF durante 20 minutos. Posteriormente se utilizó un protocolo de tinción de dos colores para determinar la eficacia de la invasión. Para probar los efectos de los dos compuestos sobre la replicación del parásito, se usaron A769662 20 μM o compuesto C 5 μM para tratar células MEF/AMPKα1-AMPKα2- (proporcionadas por el Dr. Chen-Song Zhang de la Universidad de Xiamen) infectadas con parásitos RH durante 24 h. Luego, se determinó mediante IFA el número de parásitos en cada PV, como se describió anteriormente45.

Los niveles de ATP celular se examinaron mediante un kit de ensayo de ATP comercial (Beyotime, China), que cuantifica el nivel de ATP determinando la intensidad de la luminiscencia generada por la enzima luciferasa de luciérnaga dependiente de ATP. Los parásitos recién cosechados (5 x 106) se lisaron en 100 μl de tampón de lisis en hielo durante 30 minutos y se centrifugaron a 12.000 xg durante 5 minutos. Se recogió el sobrenadante para su posterior examen. Para detectar los niveles de ATP, se mezclaron 100 μL de cada muestra o solución estándar de ATP diluida en serie (5 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM, 0,312 μM y 0,078 μM) con 100 μL de solución de trabajo de detección de ATP en opaco 96- placas de pocillos y la señal de bioluminiscencia en cada pocillo se determinó en el lector de placas Cytation5 (Biotek, EE. UU.).

Las tasas de síntesis de proteínas nacientes en parásitos se evaluaron siguiendo un método descrito previamente51. Los parásitos invadidos se cultivaron en DMEM con o sin IAA durante 35 h. Luego, los cultivos se lavaron con PBS precalentado y se cultivaron en medio DMEM libre de metionina durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió L-homopropargilglicina 100 μM (APExBIO, EE. UU.) y se incubó durante 6 h. Después del tratamiento, se recogieron los cultivos y los parásitos se liberaron con aguja de las células huésped, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 minutos, se bloquearon con suero bovino fetal al 10% durante 30 minutos. y se lavó con PBS. Luego se resuspendieron las muestras en la solución de reacción de CuAAC (TBTA 200 μM, TECP 400 μM, CuSO4 200 μM). Luego se añadió 5-isómero de azida FAM 10 μM (APExBIO, EE. UU.) a cada muestra y se incubó a 4 ° C durante la noche con agitación. Los parásitos se recogieron mediante centrifugación a 12.000 xg durante 5 minutos, se tiñeron con Hoechst (Beyotime, China) durante 20 minutos en la oscuridad, se lavaron extensamente con PBS y finalmente se resuspendieron en 300 μl de PBS. La intensidad de fluorescencia de los parásitos en cada muestra se analizó mediante un citómetro de flujo cytoflex-LX (Backman, EE. UU.), analizando más de 10 000 parásitos para cada muestra. Cada cepa y condición se probaron tres veces de forma independiente.

Los parásitos intracelulares de la cepa AMPKγ-mAID se trataron con o sin IAA durante 48 h antes de la salida. Luego, los parásitos se liberaron mediante el paso de una aguja y se purificaron mediante filtración para eliminar los restos del huésped. Posteriormente, se extrajo el ARN total de los parásitos utilizando el reactivo TransZol Up según las instrucciones del fabricante (TransGen Biotech, China). La calidad de las muestras de ARN se evaluó mediante el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent, EE. UU.). La construcción de la biblioteca se realizó con el kit de preparación de muestras de ARN TruseqTM (Illumina, EE. UU.). La secuenciación de ARN se realizó en un secuenciador HiSeq xten/NovaSeq 6000 (Illumina, EE. UU.). Luego, las lecturas limpias se mapearon en el genoma de la cepa GT1 utilizando el software Hisat2 (HISAT2 (daehwankimlab.github.io)). La expresión de genes se perfiló mediante los valores de transcripciones por millón de lecturas (TPM) a través de RSEM v1.3.1 (//deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/), y los genes expresados ​​diferencialmente se identificaron comparando sus valores de TPM utilizando DESeq2 v1.24.0 (http://bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq2/). Los genes con valor de p <0,05 y cambio de veces ≥ 2 (con tratamiento con IAA frente a sin tratamiento con IAA) se trataron como genes expresados ​​diferencialmente. El experimento se repitió tres veces de forma independiente y los datos sin procesar se depositaron en la base de datos SAR (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/) con el número de acceso PRJNA782309.

La cepa AMPKγ-mAID se pretrató con o sin IAA durante 48 h, seguido de un pase con aguja para romper las células huésped y liberar los parásitos. Luego se recogieron los taquizoítos, se purificaron mediante filtración y se lisaron en urea 8 M (Tris-Cl 0,1 M, pH 8,5) con el cóctel inhibidor de proteasa (Merk, EE. UU.) y el cóctel inhibidor de fosfatasa (Roche Applied Science, Alemania). Se prepararon tres muestras de forma independiente para cada cepa en cada condición. El lisado se sonicó y se centrifugó durante 15 minutos a 4 °C para recolectar el sobrenadante para evaluar la concentración de proteínas mediante el ensayo BCA (Thermo Scientific, EE. UU.). Luego se utilizaron 500 μg de proteína de cada muestra para la digestión. Se añadieron TCEP (Tris(2-carboxietil)fosfina, la concentración final es 5 mM) (Thermo Scientific, EE. UU.) y yodoacetamida (la concentración final es 10 mM) (Sigma-Aldrich, EE. UU.) para la reducción y alquilación a las muestras de proteínas y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min, respectivamente. La mezcla de proteínas se diluyó cuatro veces (para reducir la concentración de urea a 2 M) y se digirió a 37 °C con Lys-C a 1:100 (p/p) (Wako, Japón) durante 2 h, y luego con tripsina. a las 1:50 (p/p) (Promega, EE. UU.) durante la noche. Luego se detuvo la reacción añadiendo ácido fórmico hasta pH <2.

Las muestras digeridas se desalinizaron con un cartucho SepPak tC18 3cc Vac (Waters Corporation, EE. UU.) y se secaron mediante liofilización. Luego, las muestras se resolvieron en HEPES 100 mM (pH = 8,0) y la concentración de péptidos se midió utilizando el ensayo colorimétrico cuantitativo de péptidos (Thermo Scientific, EE. UU.). Se marcaron 100 μg de péptido de cada muestra (seis muestras en total, tres con tratamiento con IAA y tres sin él) utilizando el kit TMT six-plex (Thermo Scientific, EE. UU.) siguiendo el manual del fabricante. La eficiencia del etiquetado de muestras de cada canal se verificó como se describió anteriormente52. La reacción de marcaje se detuvo con hidroxilamina y luego se desalinizó con el cartucho tC18 Vac como se describió anteriormente.

Después del etiquetado con TMT, se mezclaron todos los péptidos de las seis muestras (600 μg en total) y se usaron 30 μg para el análisis proteómico. Las muestras se sometieron a fraccionamiento de péptidos en fase reversa con pH alto (Pierce, EE. UU.) y se adquirieron 13 fracciones para análisis LC-MS. El resto de los péptidos marcados (570 μg en total) se utilizaron para el enriquecimiento de fosfopéptidos utilizando un flujo de trabajo SMOAC, que enriqueció los fosfopéptidos secuencialmente con TiO2 e IMAC (Thermo Scientific, EE. UU.).

Para el análisis proteómico, las 13 fracciones se analizaron mediante una columna analítica casera de 30 cm de largo con punta tirada (100 μm ID x 360 μm OD, resina ReproSil-Pur C18-AQ 1,9 μm, Dr. Maisch GmbH, Alemania). Luego, la columna se colocó en línea con un nano HPLC Easy-nLC 1200 (Thermo Scientific, EE. UU.) que estaba conectado al espectrómetro de masas. La temperatura de la columna analítica se fijó en 55°C durante los experimentos. Un sistema de tampón binario (tampón A: 0,1 % de ácido fórmico en agua; tampón B: 0,1 % de ácido fórmico en 80 % de acetonitrilo) con un gradiente de 180 minutos (5 a 10 % de tampón B durante 1 min; 10 a 40 % de tampón B durante 145 min; 40–60% de tampón B durante 20 min; 60–100% de tampón B durante 1 min; 100% B durante 13 min). Los datos de MS se adquirieron mediante el espectrómetro de masas Q-Exactive (Thermo Scientific, EE. UU.) en un método top 20 dependiente de los datos con un tiempo de inyección máximo de 50 ms, un rango de exploración de 300 a 1800 m/z y un objetivo de AGC de 3×e6. MS/MS se realizó mediante fragmentación de disociación por colisión de mayor energía con un valor objetivo de 1 × e5 y un tiempo de inyección máximo de 100 ms. Se adquirieron escaneos completos de MS y MS/MS con una resolución de 70.000 y 17.500, respectivamente. La exclusión dinámica se estableció en 30 s. Las proteínas coprecipitadas con cada una de las subunidades AMPK de Toxoplasma se identificaron mediante el mismo enfoque LC-MS/MS descrito en esta sección.

Para el análisis de fosfopéptidos, cada muestra de péptido enriquecido se dividió en dos partes. La mitad se utilizó en una separación LC bidimensional en línea llamada MudPIT (Tecnología de identificación de proteínas multidimensionales) como se describió anteriormente53. La otra mitad se cargó en una única columna de fase inversa con dos réplicas técnicas. Para MudPIT, los péptidos enriquecidos se cargaron en una columna bifásica de punta extraída (75 μm ID x 360 μm OD), empaquetada en casa con resina C18 de 20 cm (resina ReproSil-Pur C18-AQ de 1,9 μm, Dr. Maisch GmbH, Alemania). seguido de resina SCX de 5 cm (5 μm, Phenomenex, EE. UU.). Luego, la columna se colocó en línea con un nano HPLC Easy-nLC 1200 (Thermo Scientific, EE. UU.) para el análisis de espectrometría de masas. Los péptidos se autoinyectaron en la fase SCX de la columna bifásica y los péptidos no unidos se analizaron mediante la columna analítica C18. Luego, los péptidos unidos a SCX se eluyeron secuencialmente con 5 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 50 %, 100 % de acetato de amonio 500 mM. Cada fracción se analizó mediante la columna de fase inversa con un gradiente de 120 min (tampón A: 0,1 % de ácido fórmico en agua; tampón B: 0,1 % de ácido fórmico en 80 % de acetonitrilo): 5–35 % de tampón B durante 95 min; 35–60% de tampón B durante 10 min; 60–100% de tampón B durante 2 min; 100% de tampón B terminado (13 min). Los datos de MS se adquirieron mediante el espectrómetro de masas Q-Exactive (Thermo Scientific, EE. UU.) en un método top 20 dependiente de los datos con un tiempo de inyección máximo de 50 ms, un rango de exploración de 300 a 1800 m/z y un objetivo de AGC de 3×e6. MS/MS se realizó mediante fragmentación de disociación por colisión de mayor energía con un valor objetivo de 5 × e5 y un tiempo de inyección máximo de 100 ms. Se adquirieron escaneos completos de MS y MS/MS con una resolución de 70.000 y 17.500, respectivamente. La exclusión dinámica se estableció en 30 s. Para los análisis de fase inversa única, el método MS fue el mismo que el método MudPIT excepto un gradiente de 180 min (5–35 % de tampón B durante 145 min; 35–60 % de tampón B durante 20 min; 60–100 % de tampón B durante 2 min; 100 % de tampón B durante 13 min). Los datos de espectrometría de masas generados en este estudio se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio del socio PRIDE con el número de identificador PXD039148.

Los datos de MS/MS adquiridos se analizaron con una base de datos de Toxoplasma gondii (ToxoDB.org) mediante Maxquant V1.6.10.43 utilizando la configuración predeterminada. La tolerancia de la masa del precursor y de la masa del fragmento se fijó en 20 ppm. La tolerancia de los principales péptidos de búsqueda se fijó en 4,5 ppm según las características del instrumento utilizado en el estudio. La carbamidometilación de cisteína (+57,021 Da) se estableció como modificaciones estáticas. El tipo de búsqueda de cuantificación eligió el ion informador ms2 utilizando el método TMT 6plex. La oxidación de metionina (+15,995 Da) y la acetilación de la proteína N terminal se establecieron como modificaciones variables para el análisis de datos proteómicos, y la fosforilación de serina/treonina/tirosina (+79,9663 Da) para los datos fosfoproteómicos. La tripsina se definió como enzima de escisión en modo completamente específico y la escisión máxima faltante se estableció en 2. La FDR de las proteínas identificadas se estableció en 1%, que se calculó a nivel de péptido.

La interpretación de los resultados proteómicos de MaxQuant se realizó en el R4.0.0. plataforma (https://www.r-project.org/). Se utilizó el paquete tidyverse (https://www.tidyverse.org/packages/) para preparar los datos y el paquete limma (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html). para ajustar los datos de expresión y calcular el cambio logarítmico y los valores p. Se utilizó la suma de los valores de intensidad del indicador (calculados por Maxquant) de todos los péptidos únicos que coinciden con una proteína determinada para comparar su abundancia entre las muestras. Las proteínas con log2 (cambio en veces) ≥ 0,58 (cambio en veces ≥ 1,5) y valor de p ≤ 0,05 se consideraron expresadas diferencialmente. La interpretación de los resultados fosfoproteómicos se realizó en las plataformas Python 3 (https://www.python.org/download/releases/3.0/) y Perseus (https://maxquant.net/perseus/). Se utilizó el paquete PaDuA en el entorno Python 3 para la limpieza de datos54, el resumen de la calidad de los datos y la visualización. Se usó Persues (v1.6) para agregar un motivo lineal y el paquete preprocessCore se usó para normalizar la intensidad del fosfopéptido55. El paquete limma se utilizó para ajustar los datos de expresión y calcular el cambio logarítmico y los valores p. El cambio de abundancia de cada fosfopéptido se normalizó mediante el cambio de veces (FC) de las proteínas correspondientes. Para las proteínas que tuvieron un cambio de abundancia significativo (proteína p ≤ 0,05), los péptidos fosforilados diferencialmente se denominaron si la FC de fosforilación/FC de abundancia de proteína ≥ 1,5 y el valor p del fosfopéptido era ≤ 0,05. Para las proteínas que no tuvieron un cambio de abundancia significativo (p > 0,05), los sitios de fosforilación con log2 (cambio de fosforilación) ≥ 0,58 y valor de p ≤ 0,05 se consideraron fosforilados diferencialmente.

A excepción de los datos transcriptómicos y proteómicos, todos los demás resultados se analizaron con Prism 8 (GraphPad Software Inc., EE. UU.). Los tamaños de muestra se eligieron de acuerdo con experimentos similares publicados en publicaciones anteriores. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student de dos colas no pareada o ANOVA de dos vías con las pruebas posteriores de comparaciones múltiples de Tukey, como se indica en las leyendas de las figuras. Todos los resultados de IFA o de transferencia Western se repitieron al menos dos veces utilizando muestras preparadas de forma independiente y se obtuvieron resultados similares. Sólo se mostraron imágenes representativas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-Seq generados en este estudio se depositaron en la base de datos SRA con el código de acceso PRJNA782309. Los datos fosfoproteómicos generados en este estudio se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio del socio PRIDE con el número de identificador PXD039148. Todos los demás datos se presentan en el artículo o en la información complementaria. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Hill, DE & Dubey, JP Toxoplasma gondii como parásito en los alimentos: análisis y control. Microbiol. Espectro. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.PFS-0011-2015 (2016).

Lourido, S. Toxoplasma gondii. Tendencias Parasitol. 35, 944–945 (2019).

Artículo de Google Scholar

Farhat, DC y Hakimi, MA Las trayectorias de desarrollo del toxoplasma se derivan de un elaborado cableado epigenético. Tendencias Parasitol. 38, 37–53 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Waldman, BS y cols. Identificación de un regulador maestro de diferenciación en toxoplasma. Celda 180, 359–372.e316 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Pittman, KJ, Aliota, MT y Knoll, LJ Perfil transcripcional dual de ratones y toxoplasma gondii durante la infección aguda y crónica. Genoma de BMC. 15, 806 (2014).

Artículo de Google Scholar

Fleige, T., Fischer, K., Ferguson, DJ, Gross, U. y Bohne, W. Metabolismo de carbohidratos en el apicoplasto de Toxoplasma gondii: localización de tres isoenzimas glucolíticas, el único complejo de piruvato deshidrogenasa y un translocador de fosfato de plastidio. Eucariota. Celda 6, 984–996 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Lyu, C. y col. Papel de la síntesis de amilopectina en Toxoplasma gondii y su implicación en el desarrollo de vacunas contra la toxoplasmosis. Biol abierto. 11, 200384 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Sugi, T., Tu, V., Ma, Y., Tomita, T. & Weiss, LM Toxoplasma gondii requiere glucógeno fosforilasa para equilibrar el almacenamiento de amilopectina y para la producción eficiente de quistes cerebrales. mBio 8, e01289-e01317 (2017).

Uboldi, AD et al. La regulación de las reservas de almidón por una proteína quinasa dependiente de Ca(2+) es esencial para el desarrollo viable de quistes en Toxoplasma gondii. Microbio huésped celular 18, 670–681 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Pomel, S., Luk, FC y Beckers, CJ La salida y la invasión de las células huésped inducen marcadas reubicaciones de enzimas glucolíticas en los taquizoítos de Toxoplasma gondii. Patógeno PLoS. 4, e1000188 (2008).

Artículo de Google Scholar

Frenal, K., Dubremetz, JF, Lebrun, M. y Soldati-Favre, D. La motilidad deslizante potencia la invasión y salida en Apicomplexa. Nat. Rev. Microbiol. 15, 645–660 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

MacRae, JI y cols. El metabolismo mitocondrial de la glucosa y la glutamina es necesario para el crecimiento intracelular de Toxoplasma gondii. Microbio huésped celular 12, 682–692 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Lin, SC y Hardie, DG AMPK: Detección de glucosa y estado de energía celular. Metabolismo celular. 27, 299–313 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

González, A., Hall, MN, Lin, SC y Hardie, DG AMPK y TOR: El Yin y el Yang de la detección de nutrientes celulares y el control del crecimiento. Metabolismo celular. 31, 472–492 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Kurumbail, RG & Calabrese, MF Estructura y regulación de AMPK. Exp. Supl. 107, 3-22 (2016).

CAS Google Académico

Hedbacker, K. y Carlson, M. Vías SNF1/AMPK en levadura. Biosci frontal. 13, 2408–2420 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Gu, X. y col. Deconvolución y detección de nucleótidos de adenina de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK). J. Biol. Química. 292, 12653–12666 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Chen, L. y col. La proteína quinasa activada por AMP sufre cambios conformacionales dependientes de nucleótidos. Nat. Estructura. Mol. Biol. 19, 716–718 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Yan, Y., Zhou, XE, Xu, HE y Melcher, K. Estructura y regulación fisiológica de AMPK. En t. J. Mol. Ciencia. 19, 3534 (2018).

Sanz, P., Rubio, T. & García-Gimeno, MA Subunidades AMPKbeta: más que un simple andamio en la formación del complejo AMPK. FEBS J. 280, 3723–3733 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Zheng, D. y col. Regulación de la transcripción del GLUT-4 muscular por la proteína quinasa activada por AMP. J. Appl Physiol. (1985) 91, 1073–1083 (2001).

Artículo CAS Google Scholar

Ross, FA, MacKintosh, C. y Hardie, DG Proteína quinasa activada por AMP: un sensor de energía celular que viene en 12 sabores. FEBS J. 283, 2987–3001 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Saldivia, M., Ceballos-Perez, G., Bart, JM & Navarro, M. La vía AMPKalpha1 regula positivamente la transición del desarrollo desde la proliferación a la inactividad en trypanosoma brucei. Representante celular 17, 660–670 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Sternlieb, T., Schoijet, AC, Genta, PD, Vilchez Larrea, SC y Alonso, GD Un complejo de proteína quinasa activada por AMP con dos subunidades alfa distintivas está involucrado en las respuestas al estrés nutricional en Trypanosoma cruzi. PLoS Negl. tropo. Dis. 15, e0009435 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Hardie, DG, Salt, IP, Hawley, SA y Davies, SP Proteína quinasa activada por AMP: un sistema ultrasensible para monitorear la carga de energía celular. Biochem J. 338, 717–722 (1999).

Artículo CAS Google Scholar

Zong, Y. et al. La activación jerárquica de grupos compartimentados de AMPK depende de la gravedad del estrés nutricional o energético. Resolución celular. 29, 460–473 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Brown, KM, Long, S. y Sibley, LD La asociación de la membrana plasmática mediante N-acilación gobierna la función de PKG en Toxoplasma gondii. mBio 8, e00375–e00417 (2017).

Li, M. y col. La aldolasa es un sensor de niveles altos y bajos de glucosa y se vincula a AMPK y mTORC1. Resolución celular. 31, 478–481 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Lee, JH y cols. Regulación dependiente de energía de la estructura celular mediante la proteína quinasa activada por AMP. Naturaleza 447, 1017-1020 (2007).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Violett, B. y col. AMPK: Lecciones de animales transgénicos y knockout. Biosci frontal. (Ed. Landmark) 14, 19–44 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Mancio-Silva, L. et al. La detección de nutrientes modula la virulencia del parásito de la malaria. Naturaleza 547, 213–216 (2017).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Sidik, SM y cols. Una prueba CRISPR de todo el genoma en toxoplasma identifica genes apicomplejos esenciales. Celda 166, 1423–1435 e1412 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Shaw, RJ y cols. La quinasa supresora de tumores LKB1 activa directamente la quinasa activada por AMP y regula la apoptosis en respuesta al estrés energético. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 101, 3329–3335 (2004).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Woods, A. y col. LKB1 es la quinasa aguas arriba en la cascada de proteína quinasa activada por AMP. actual. Biol. 13, 2004-2008 (2003).

Artículo CAS Google Scholar

Woods, A. y col. La proteína quinasa quinasa beta dependiente de Ca2+/calmodulina actúa aguas arriba de la proteína quinasa activada por AMP en células de mamíferos. Metabolismo celular. 2, 21–33 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Hawley, SA y cols. La proteína quinasa quinasa beta dependiente de calmodulina es una quinasa ascendente alternativa para la proteína quinasa activada por AMP. Metabolismo celular. 2, 9-19 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Hong, SP, Leiper, FC, Woods, A., Carling, D. y Carlson, M. Activación de levadura Snf1 y proteína quinasa activada por AMP de mamíferos mediante quinasas ascendentes. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. EE.UU. 100, 8839–8843 (2003).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Bisio, H. & Soldati-Favre, D. Cascadas de señalización que gobiernan la entrada y salida de las células huésped por parte de Toxoplasma gondii. Annu Rev. Microbiol 73, 579–599 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Lourido, S. et al. La proteína quinasa 1 dependiente de calcio es un regulador esencial de la exocitosis en Toxoplasma. Naturaleza 465, 359–362 (2010).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Treeck, M. y col. La proteína quinasa 3 dependiente de calcio del toxoplasma influye en los niveles basales de calcio y funciona más allá de la salida, como lo revela el análisis cuantitativo de fosfoproteoma. Patógeno PLoS. 10, e1004197 (2014).

Artículo de Google Scholar

Afinanisa, Q., Cho, MK y Seong, HA Localización de AMPK: una clave para la regulación energética diferencial. En t. J. Mol. Ciencia. 22, 10921 (2021).

Zhang, CS y cols. La fructosa-1,6-bifosfato y la aldolasa median la detección de glucosa por parte de AMPK. Naturaleza 548, 112-11 (2017).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Hardie, DG La vía de la proteína quinasa activada por AMP: nuevos actores en sentido ascendente y descendente. J. Ciencia celular. 117, 5479–5487 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Schmitt, DL y cols. Regulación espacial de la señalización de AMPK revelada por un informador sensible de la actividad de la quinasa. Nat. Comunitario. 13, 3856 (2022).

Xia, N. y col. La homeostasis del piruvato como determinante del crecimiento del parásito y la plasticidad metabólica en Toxoplasma gondii. mBio 10, e00898–e00919 (2019).

Blume, M. y col. La glucosa derivada del huésped y su transportador en el patógeno intracelular obligado Toxoplasma gondii son prescindibles mediante glutaminolisis. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 106, 12998–13003 (2009).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Shen, B. y Sibley, LD La aldolasa de Toxoplasma es necesaria para el metabolismo, pero prescindible para la invasión de las células huésped. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 111, 3567–3572 (2014).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Shen, B., Brown, KM, Lee, TD y Sibley, LD Alteración genética eficiente en diversas cepas de Toxoplasma gondii utilizando CRISPR/CAS9. mBio 5, e01114 – e01114 (2014).

Artículo de Google Scholar

Shen, B., Brown, K., Long, S. y Sibley, LD Desarrollo de CRISPR/Cas9 para la edición eficiente del genoma en toxoplasma gondii. Métodos Mol. Biol. 1498, 79-103 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Ye, S. et al. La proteína micronemal 13 contribuye al crecimiento óptimo de Toxoplasma gondii en condiciones de estrés. Parasitol. Res. 118, 935–944 (2019).

Artículo de Google Scholar

Dieterich, DC y cols. Visualización in situ y dinámica de proteínas recién sintetizadas en neuronas del hipocampo de rata. Nat. Neurociencias. 13, 897–905 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Mertins, P. y col. Flujo de trabajo reproducible para el análisis multiplexado de proteomas y fosfoproteomas a gran escala de tejidos tumorales mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas. Nat. Protocolo. 13, 1632-1661 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Wolters, DA, Washburn, MP y Yates, JR 3. Una tecnología automatizada de identificación de proteínas multidimensional para proteómica de escopeta. Anal. Química. 73, 5683–5690 (2001).

Artículo CAS Google Scholar

Ressa, A., Fitzpatrick, M., van den Toorn, H., Heck, AJR y Altelaar, M. PaDuA: una biblioteca de Python para análisis de datos proteómicos (fosfo) de alto rendimiento. J. Proteoma Res. 18, 576–584 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Lachmann, A. y col. Extracción masiva de datos de RNA-seq disponibles públicamente de humanos y ratones. Nat. Comunitario. 9, 1366 (2018).

ADS del artículo Google Scholar

Descargar referencias

Los autores quieren agradecer al Dr. Chen-Song Zhang por proporcionar las células MEF que carecen de AMPKα1 y AMPKα2, así como al Prof. David Sibley (Universidad de Washington en St Louis) y al Dr. Nishith Gupta (Universidad Humboldt en Berlín) por la lectura crítica de el manuscrito. Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención nº 31961133032 y 31822054, ambas para BS).

Estos autores contribuyeron igualmente: Zhipeng Niu, Jichao Yang, Xuke Yang.

Laboratorio Estatal Clave de Microbiología Agrícola, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, Provincia de Hubei, 430070, República Popular China

Yaqiong Li, Zhipeng Niu, Jichao Yang, Xuke Yang, Yukun Chen, Yingying Li, Xiaohan Liang, Jingwen Zhang, Fuqiang Fan y Bang Shen

Centro Nacional para la Ciencia de las Proteínas en Shanghai, Laboratorio Zhangjiang, Instituto de Investigación Avanzada de Shanghai, Academia China de Ciencias, Shanghai, 201210, RP China

Ping Wu y Chao Peng

Laboratorio clave de medicina preventiva en la provincia de Hubei, Wuhan, provincia de Hubei, 430070, República Popular China

Explosión Shen

Laboratorio Hubei Hongshan, Wuhan, provincia de Hubei, 430070, República Popular China

Explosión Shen

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

YL (Yaqiong Li), JY, XY y BS diseñaron la investigación; YL (Yaqiong Li), JY, ZN, YC, YL (Yingying Li), XL, JZ, FF y PW realizaron los experimentos; YL (Yaqiong Li), ZN, JY, XY, PW y CP analizaron los datos; YL (Yaqiong Li), PW y BS escribieron el artículo.

Correspondencia a Bang Shen.

Los autores no declaran ningún interés en conflicto.

: Nature Communications agradece a Guillermo Alonso y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Li, Y., Niu, Z., Yang, J. et al. Rápida reprogramación metabólica mediada por la proteína quinasa activada por AMP durante el ciclo lítico de Toxoplasma gondii. Nat Comuna 14, 422 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36084-0

Descargar cita

Recibido: 05 de febrero de 2022

Aceptado: 12 de enero de 2023

Publicado: 26 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36084-0

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.