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Aug 01, 2023

STING programado químicamente

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4584 (2023) Cite este artículo 1786 Accesos 11 Detalles de Altmetric Metrics El microambiente tumoral (TME), a menudo inmunosupresor, puede obstaculizar el sistema inmunológico.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4584 (2023) Citar este artículo

1786 Accesos

11 altmétrico

Detalles de métricas

El microambiente tumoral (TME), a menudo inmunosupresor, puede dificultar la evasión inmune y la respuesta a las terapias de bloqueo de puntos de control. La activación farmacológica de la vía STING crea un TME inmunológicamente caliente; sin embargo, la administración sistémica podría provocar respuestas inflamatorias no deseadas y fuera del objetivo. Aquí, generamos un pequeño panel de profármacos activables por esterasa basados ​​en la estructura del agonista STING no nucleotídico MSA-2 que posteriormente se incorporan de manera estable en una vesícula liposomal para administración intravenosa. Las propiedades farmacocinéticas y la capacidad de estimulación inmunológica de los profármacos administrados a través de liposomas (SAProsomas) aumentan en comparación con la forma del fármaco libre. Al realizar una detección de eficacia entre los SAProsomas que incorporan diferentes profármacos en modelos de tumores de ratón singénicos, encontramos que el rendimiento terapéutico superior depende de una mejor administración a los compartimentos linfoides y tumorales deseados. El mejor candidato, SAProsoma-3, estimula en gran medida la secreción de citoquinas inflamatorias y crea un paisaje inmunológico tumoricida. En particular, tras su aplicación en modelos de ratones con cáncer de mama o melanoma, SAProsome-3 provoca una remisión duradera de los tumores establecidos y una supervivencia posquirúrgica libre de tumores, al tiempo que disminuye la carga metastásica sin una toxicidad sistémica significativa. En resumen, nuestro trabajo establece la prueba de principio para una terapia con agonistas de STING mejor dirigida, más eficiente y segura.

La inmunoterapia contra el cáncer que utiliza inhibidores del bloqueo de puntos de control inmunológico (ICB) (p. ej., anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 y anti-CTLA-4) ha logrado un éxito clínico notable, produciendo respuestas terapéuticas duraderas y a largo plazo en múltiples tipos de cáncer1. Sin embargo, sólo un pequeño subconjunto de pacientes se beneficia de este tratamiento2. Muchos tumores inaccesibles son inmunológicamente fríos y se caracterizan por la abundante infiltración de inmunosupresores, pero carecen de linfocitos infiltrantes de tumores, lo que les permite escapar de la vigilancia inmunitaria3,4. En consecuencia, la mayoría de los cánceres presentan una abrumadora refractariedad de novo a los anticuerpos ICB aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos5,6,7. Por lo tanto, se espera que los enfoques inmunoterapéuticos eficaces más allá de aquellos dirigidos directamente a la respuesta inmune adaptativa beneficien a grandes poblaciones de pacientes con cáncer y, por lo tanto, se necesitan desesperadamente8,9,10,11.

El estimulador de genes de interferón (STING) es un receptor de señalización intracelular que regula la vía inmune innata y es fundamental para el inicio de la inmunidad antitumoral12. La activación farmacológica de STING a través de dinucleótidos cíclicos (CDN) endógenos, como el 2',3'-monofosfato de guanosina-monofosfato de adenosina cíclico (cGAMP), que provoca la inducción de interferones tipo I (IFN) y otras citocinas proinflamatorias. Esto estimula aún más la activación de las células dendríticas (CD) y la presentación cruzada de antígenos tumorales, revirtiendo la desertificación inmune del tumor13,14. Se han centrado importantes esfuerzos en el desarrollo de derivados de CDN que imitan el cGAMP endógeno15,16,17. Sin embargo, la eficacia de estos agonistas se ve considerablemente comprometida debido a la inestabilidad metabólica y la rápida eliminación del organismo después de la administración sistémica. La administración terapéutica de agonistas de STING basados ​​en CDN en el citosol de las células diana es difícil debido a la alta hidrofilicidad y carga negativa de la molécula18,19. Además, los agonistas de STING de molécula pequeña inyectados por vía intravenosa pueden generar una diseminación sistémica incontrolada y respuestas inflamatorias generalizadas20. Por lo tanto, los ensayos clínicos actuales con agonistas de STING basados ​​en CDN se centran en la inyección intratumoral directa, lo que limita su implementación clínica a pacientes con tumores sólidos accesibles21,22. Sin embargo, la estimulación de la inmunidad antitumoral a través de un régimen sistémico intravenoso imparte una ventaja notable en la eliminación de lesiones cancerosas quirúrgicamente irresecables y, en particular, metastizadas23. Los desafíos antes mencionados han provocado la investigación de sistemas activadores de STING para la conducción y la rápida expansión de sus ensayos de inmunoterapia para combatir el cáncer. MSA-2 es un agonista activador de STING no nucleotídico desarrollado recientemente. Este agente se ha administrado por vía oral en estudios con animales, aunque la baja biodisponibilidad oral y la entrada citosólica inadecuada pueden limitar su eficacia antitumoral24. Nuestra hipótesis es que el resto carboxilo (10-OH) en la molécula MSA-2 puede explicar su mala compatibilidad con los transportadores de fármacos y que esto podría mejorarse mediante una derivatización química racional.

Aquí desarrollamos vesículas liposomales activadoras de STING que atrapan profármacos MSA-2 diseñados para aprovechar la inmunidad antitumoral innata (Fig. 1a-c). La cinética de activación de fármacos de estas entidades profármaco de tipo morfolina (MP) se puede ajustar mediante números variables de hidrocarburos, lo que permite la selección de candidatos que pueden liberar rápidamente fármacos activos para una activación STING eficaz. Revelamos una relación estructura-actividad notablemente sólida para liposomas de profármacos agonistas de STING (SAProsomes) diseñados, lo que permite su optimización en términos de formulación adaptativa y eficacia antitumoral in vivo. En particular, al administrarse a los modelos 4T1 de cáncer de mama triple negativo y B16F10 de cáncer de melanoma, que son en gran medida refractarios a la terapia con ICB, SAProsome prepara la inmunidad antitumoral, la remisión duradera de los tumores establecidos, la supervivencia posquirúrgica libre de tumores y la inhibición de la carga metastásica. Por lo tanto, este estudio destaca el potencial de los profármacos STING optimizados mediante administración liposomal como tratamientos prometedores para mejorar la inmunidad antitumoral.

a, b Diseño racional de los profármacos STING 1–4 derivados de MSA-2 mediante un enlace éster hidrolítico para optimizar la administración liposomal in vivo. Los profármacos fueron diseñados para ser hidrolizados por esterasa para liberar espontáneamente MSA-2 activo en las células diana. A diferencia del MSA-2 libre, estos profármacos se pueden ensamblar de manera estable en constituyentes lipídicos para formar vesículas liposomales. c Ilustración esquemática de la activación de MSA-2 en respuesta a esterasa como una molécula activadora de STING seguida de estimulación inmune antitumoral en ratones portadores de tumores. d Cinética de activación de fármacos de los profármacos 1 a 4 en presencia o ausencia de esterasa hepática porcina (PLE, 50 unidades/ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C. Los datos se presentan como ± sd de la media, n = 3. e, f Extrapolación de constantes de velocidad de pseudoprimer orden de las curvas en (e) cuando los profármacos se incubaron en PBS que contenía PLE. Los datos se presentan como ± sd de la media, n = 3. g Imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) e imágenes crio-TEM de SAProsoma-3. Cada experimento se repitió independientemente por triplicado, arrojando resultados similares. h, i Estabilidad de los SAProsomas. Los tamaños de partículas (h) y el índice de polidispersidad (PDI) (i) se controlaron mediante análisis dinámico de dispersión de luz durante 72 h. Los datos se presentan como ± sd de la media, n = 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se seleccionó un agonista STING no nucleotídico descubierto recientemente, MSA-2, para probar la validez de nuestro diseño de fármaco. Para facilitar la formulación liposomal de MSA-2, inicialmente se construyeron cuatro derivados sintéticos de MSA-2 (compuestos 1 a 4) mediante enlaces éster utilizando alcanoles de tipo MP de diferentes longitudes como modificadores (Fig. 1a; para obtener detalles de síntesis, consulte la Información complementaria). ). Sus estructuras químicas se confirmaron inequívocamente mediante resonancia magnética nuclear de protones y espectrometría de masas de alta resolución (Figuras complementarias S1 a S10). Intentamos reducir la polaridad del grupo carboxilo en MSA-2 mediante derivatización química utilizando MP para permitir el ensamblaje eficiente de los profármacos en nanovesículas liposomales. El enlace éster es susceptible a la hidrólisis catalizada por esterasa en tumores, lo que permite la liberación in situ de agonistas químicamente no modificados para la activación de STING25,26,27,28. Luego investigamos la activación de MSA-2 desencadenada por esterasa por parte de los profármacos29. Los profármacos MSA-2 exhibieron una cinética hidrolítica sintonizable y dependiente de la longitud del conector en presencia de esterasa hepática porcina (PLE) (Fig. 1d). Aunque todos los profármacos fueron resistentes a la hidrólisis en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C en ausencia de PLE, la mayoría de los profármacos (~90%) se convirtieron en agonistas de STING químicamente no modificados en 30 minutos en el Presencia de esterasa in vitro. Las constantes de velocidad de pseudoprimer orden (± DE) para la liberación de agonistas de STING de estos profármacos fueron 31,9 ± 0,3 × 10-3 min-1 (profármaco 1), 23,9 ± 3,5 × 10-3 min-1 ( profármaco 2), 64,1 ± 0,2 × 10−3 min−1 (profármaco 3) y 199,1 ± 1,2 × 10−3 min−1 (profármaco 4) (Fig. 1e, f).

A continuación, probamos la capacidad de estos profármacos MSA-2 para ensamblarse en nanovesículas liposomales (SAProsomas). La molécula original MSA-2 era inmiscible con componentes liposomales, produciendo precipitados exclusivamente en soluciones acuosas. Por el contrario, siguiendo el protocolo de nanoprecipitación, los profármacos 1 a 4 de MSA-2 fueron altamente compatibles con los componentes liposomales, con una eficiencia de carga de> 90% para los diferentes profármacos (Tabla S1). Se formaron estructuras liposomales de tamaño nanométrico típicas para estas nanopartículas cargadas de profármacos, como lo demuestran las observaciones de microscopía electrónica de transmisión y crioelectrónica (Fig. 1g)30. Además, estos SAProsomas exhibieron un diámetro promedio z adecuado de ~120 nm, medido por dispersión dinámica de la luz, y una distribución de tamaño estrecha, como se refleja en un bajo índice de polidispersidad. Todos los SAProsomas, excepto SAProsoma-4, permanecieron suficientemente estables en soluciones tamponadas con suero (20%, p/v) (Fig. 1h, i).

Posteriormente, se investigó si los SAProsomas podrían facilitar la captación celular y preservar la actividad inmunoestimuladora de los agonistas de STING. La fluorescencia intrínseca de MSA-2 se evaluó para cuantificar la concentración intracelular del fármaco, ya que los espectros de fluorescencia no se vieron afectados independientemente de la derivatización química (Figura complementaria S11). La exposición de células a SAProsomas generó señales de fluorescencia derivadas de MSA-2 sustancialmente más altas que la exposición a MSA-2 libre (Fig. 2a, b), lo que sugiere que la absorción celular de MSA-2 se aceleró mediante la administración liposomal. Investigamos más a fondo si el aumento del suministro citosólico contribuía a una mayor señalización inflamatoria. La estimulación in vitro de células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) utilizando SAProsoma aumentó la expresión de ARNm de citocinas reguladas por STING posteriores, como IFN-β, factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) y ligando 10 de quimiocina (motivo CXC) ( CXCL10), mientras que el MSA-2 libre fue menos eficaz para aumentar las expresiones de ARNm de citocinas posteriores (Fig. 2c). CXCL10 ha sido implicado como un quimioatrayente para promover la infiltración intratumoral de células T, mientras que el IFN-β y el TNFα son inmunomoduladores cruciales para mejorar las respuestas antitumorales31,32,33. Además, se observó en las BMDC una secreción dependiente de la dosis de la citoquina crítica, IFN-β, después del tratamiento con SAProsomas (Fig. 2d), lo que permitió identificar la actividad superior de los SAProsomas-3 y 4 con una concentración efectiva media máxima relativamente baja. (CE50). Además, validamos su potencial de activación de STING en la línea celular monocítica humana THP1. De acuerdo con los resultados in vitro, el MSA-2 activo se liberó espontáneamente del SAProsoma-3 después de la captación celular (Figura complementaria S12). Además, el tratamiento con SAProsoma-3 no solo aumentó las expresiones de ARNm de IFN-β, TNFα y CXCL10, sino que también desencadenó cascadas de señalización descendentes de STING, induciendo la fosforilación de la proteína STING, la quinasa de unión a TANK 1 (TBK1) y el factor regulador de IFN 3. IRF-3) en células THP1 (Figura complementaria S13).

a, b Perfiles de intensidad de fluorescencia intracelular de MSA-2 cuantificados mediante citometría de flujo (panel izquierdo). Los sapsosomas mejoran la entrega citosólica de MSA-2 en CD derivadas de médula ósea (BMDC) (a) o células THP-1 (b). Las células se incubaron con MSA-2 libre o diferentes SAProsomas (equivalencia de MSA-2 40 µM). Histogramas de citometría de flujo representativos que muestran la absorción de MSA-2 fluorescente o profármacos después de una incubación de 24 h (panel derecho). Los datos se presentan como ± sd de la media, n = 3 células biológicamente independientes. c Expresión posterior dependiente de STING de citoquinas inflamatorias en BMDC tratadas con MSA-2 o SAProsomas según lo evaluado mediante qRT-PCR (n = 3). d Curvas dosis-respuesta de la secreción de IFN-β tras diversos tratamientos. La concentración de IFN-β en el medio de cultivo BMDC se determinó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los datos se presentan como ± sd de la media, n = 3 muestras biológicamente independientes. e, f Después del tratamiento con SAProsomas, los BMDC exhiben marcadores de activación significativamente aumentados, incluido el complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II) (e) y CD80/CD86 (f) (n = 3). g Presentación cruzada de antígeno aumentada de BMDC inducida por SAProsomas. Los porcentajes de células presentadoras de ovoalbúmina (OVA, SIINFEKL) se determinaron mediante citometría de flujo (n = 3). h El cotratamiento con el péptido OVA y SAProsomas aumentó la lisis de las células B16F10-OVA a través de linfocitos T citotóxicos in vitro. En el lado izquierdo se muestra el protocolo experimental, que se creó con BioRender.com. La citotoxicidad celular se determinó en función de la concentración de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante del medio, medida mediante el ensayo de LDH (n = 3 muestras biológicamente independientes). Las proporciones del número de células (células T/B16F10 o células B16F10-OVA/BMDC) se fijaron en 10:1:5. En (c, e – h), los datos se presentan como la media ± sd y se analizan estadísticamente mediante un análisis de varianza unidireccional. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dada la actividad superior de los SAProsomas para estimular la vía STING y la secreción de IFN-β, investigamos más a fondo si esta estimulación indujo la maduración de las CD in vitro. El análisis de maduración de DC reveló que los SAProsomas aumentaron significativamente la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC II) y los marcadores coestimuladores de CD80/CD86 en BMDC (Fig. 2e, f). La inducción general de la maduración de DC a través de todos los SAProsomas mostró una respuesta comparable, aunque el SAProsoma-4 exhibió una eficiencia de absorción celular y una secreción de IFN-β superiores. La maduración de las CD va acompañada de una mayor capacidad de presentación de antígenos34. Por lo tanto, evaluamos la capacidad de los SAProsomas para promover el antígeno fagocitado mediante presentación cruzada a las superficies de BMDC. Los BMDC expuestos a SAProsomas mejoraron significativamente la presentación de SIINFEKL-H-2Kb entre 2,9 y 3,4 y entre 1,8 y 2,1 veces en comparación con la presentación en células tratadas con solución salina y MSA-2 libre, respectivamente (Fig. 2g). Fundamentalmente, el tratamiento previo de las BMDC con SAProsomas y un antígeno específico del tumor (p. ej., OVA) mejoró significativamente la citotoxicidad de las células T esplénicas contra las células tumorales (B16F10-OVA), en comparación con las células no tratadas (Fig. 2h). Por el contrario, las células T esplénicas tenían una citotoxicidad limitada contra las células tumorales B16F10. Estos resultados experimentales indican que la esterasa intracelular puede desencadenar espontáneamente la liberación de MSA-2 activo, lo que eventualmente facilita la activación de la vía STING y conduce a una mayor secreción de citoquinas.

Las vesículas liposomales del profármaco MSA-2 permitieron la administración sistémica mediante inyección intravenosa. Primero se incluyó un modelo de ratón preclínico con tumor colorrectal subcutáneo MC38 para probar la eficacia antitumoral de estos SAProsomas en comparación con el MSA-2 libre que está disponible por vía oral (Fig. 3a). Se observó una reducción significativa del tumor después de tres inyecciones intravenosas de SAProsomas, mientras que la dosificación de MSA-2 libre a 35 mg/kg no logró impedir el crecimiento del tumor. Este resultado fue respaldado aún más por la cinética de crecimiento del tumor monitoreada cada dos días (Fig. 3b-f). A modo de comparación, los liposomas vacíos sin cargas útiles de profármacos no mostraron ningún beneficio antitumoral en este modelo (Figura complementaria S14). Los SAProsomas parecían ser seguros y bien tolerados en los animales, como lo demuestra el crecimiento estable del peso corporal de los ratones (Fig. 3c). El tratamiento con SAProsoma generó una regresión tumoral (CR) completa y las tasas de inhibición tumoral dependieron en gran medida de los profármacos MSA-2 encapsulados. En particular, SAProsome-3 superó a los otros SAProsomas con una tasa de RC del 100% y todos los ratones (n = 10) permanecieron libres de tumores en el criterio de valoración del estudio (Fig. 3d). La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones tumorales reveló áreas necróticas más altas en los tumores de ratones tratados con SAProsoma-3, lo que se verificó además mediante análisis inmunohistoquímico TUNEL (Fig. 3g y Figs. Suplementarias S15 y 16). Sin embargo, sorprendentemente, los tumores en ratones tratados con MSA-2 libre albergaban pocas células T CD8+, mientras que los tumores de ratones tratados con SAProsoma-3 estaban abundantemente infiltrados con células T CD8+ y acompañados por la profusa difusión de granzima B, una característica definitoria de Función de las células T (Fig. 3g y Fig. Suplementaria S17). Además, el tratamiento con SAProsoma aumentó efectivamente el tiempo de supervivencia en comparación con el observado con la administración de MSA-2 libre (tiempo medio de supervivencia [MST]: MSA-2 = 15 días; SAProsomas-1, 2 y 4 = 93–99 días) (Fig. .3h). De acuerdo con las curvas de crecimiento tumoral, SAProsome-3 extendió sustancialmente la MST de ratones con tumores durante 150 días.

a Esquema del diseño experimental que involucra un modelo de tumor de ratón singénico. A ratones con tumores subcutáneos de aproximadamente 100 mm3 se les administró por vía intravenosa SAProsomas tres veces en una dosis equivalente a MSA-2 de 35 mg/kg. Para comparación, se incluyó MSA-2 libre administrado mediante sonda oral o solución salina. Cinética de crecimiento tumoral (b) y cambios de peso corporal (c) en los diferentes grupos (n = 10 ratones/grupo). Los datos se presentan como media ± DE y se analizan estadísticamente mediante la prueba t de Student de dos colas. d Curvas de crecimiento tumoral para ratones individuales (CR, respondedor completo). e Fotografías representativas de los tumores MC38 el día 12. f Gráfico en cascada que muestra la respuesta de los tumores MC38 a diferentes tratamientos después de 12 días (los valores representan el cambio de volumen en comparación con el valor inicial antes del tratamiento). g Tinción representativa de hematoxilina y eosina, análisis de etiquetado de extremo de mella dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) y ensayo de inmunofluorescencia de células T CD8+ citotóxicas en tumores extirpados el día 10 después del tratamiento. Se realizaron triplicados de forma independiente con resultados similares. h Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (n = 10 ratones/grupo). La significación estadística se determinó mediante pruebas de rango logarítmico (Mantel-Cox). i Curvas de crecimiento tumoral y análisis de supervivencia de Kaplan-Meier después de la reinoculación de células MC38 en ratones, que no muestran recurrencia del tumor secundario en ratones tratados con SAProsoma-3 (n = 10/grupo). Se incluyeron como control ratones que no habían recibido tratamiento previo (n = 10/grupo). Los datos se presentan como media ± DE y se analizan estadísticamente mediante la prueba t de Student de dos colas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar más a fondo los efectos de la memoria inmunológica, los ratones tratados con SAProsoma-3 que sobrevivieron el día 150 después de la primera inoculación de células tumorales MC38 se volvieron a exponer a células MC3835. En comparación con el rápido crecimiento tumoral en los ratones que no habían recibido tratamiento previo, todos los ratones tratados con SAProsoma-3 carecieron de recurrencia del tumor secundario durante el período de observación de 60 días, lo que indica el establecimiento de una memoria inmunológica duradera específica del tumor (Fig. 3i).

A continuación, analizamos la diferencia en los efectos inmunorreguladores en los tejidos tumorales de ratones tratados con SAProsoma-3 y MSA-2 libre mediante citometría de flujo. La administración de SAProsoma-3 expandió significativamente los subconjuntos de células T citotóxicas CD3 + CD8 + en tumores en comparación con el tratamiento con MSA-2 libre (Fig. 4a y Fig. Suplementaria S18). La proporción de células T CD8+/CD4+, un indicador pronóstico crítico para los resultados de la inmunoterapia, aumentó significativamente después del tratamiento con SAProsoma-3 en comparación con el grupo no tratado (2,82 versus 0,26, P = 0,0000004)36. Las poblaciones de células T CD4 + y CD8 + efectoras múltiples estaban altamente enriquecidas en los tumores de ratones inmunizados con SAProsoma-3 (Fig. 4b). En particular, hubo un aumento significativo en las células T IFN-γ+CD8+ activadas en ratones tratados con SAProsoma-3 en comparación con el observado en los grupos no tratados o MSA-2 (37,2% versus 15,7% o 18,0%, P = 0,000002 o P = 0,000009, respectivamente). Además, la expresión superficial de CD206, un marcador canónico de macrófagos polarizados M2, disminuyó drásticamente en los macrófagos de tumores de ratón tratados con SAProsoma-3 (Fig. 4c y Fig. Suplementaria S19), lo que sugiere la repolarización o reclutamiento de macrófagos durante la reducción. actividad inmunosupresora37,38. La afluencia de células asesinas naturales (NK) que se infiltran en tumores aumentó significativamente durante el tratamiento con SAProsoma-3 que durante el tratamiento con MSA-2 libre (Fig. 4d). Además, se observó un aumento de la expresión de DC de CD80/CD86 coestimulador en el TME, lo que coincide con el aumento sustancial de las células T CD8+ tumorales en ratones tratados con SAProsoma-3 (Fig. 4e y Fig. Suplementaria S20). Se sabe que las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) exhiben actividad inmunosupresora y son importantes en la evasión inmune de tumores. Aquí, el tratamiento con SAProsoma-3 redujo sustancialmente la infiltración de MDSC intratumorales en comparación con otros tratamientos (Fig. 4f, g).

a Gráficos de citometría de flujo de células T en tejido tumoral MC38 analizados el día 10 después del tratamiento (activación de células CD3+, n = 8 ratones/grupo para muestras biológicamente independientes). b La tinción de citoquinas intracelulares para evaluar la producción de TNFα e IFN-γ por células T CD4+ y CD8+ infiltrantes de tumores en respuesta a la estimulación con acetato de forbol miristato/ionomicina y la frecuencia de células T CD107a+ en los tumores se analizaron mediante citometría de flujo (n = 9 biológicamente muestras independientes). c Gráficos de citometría de flujo y análisis cuantitativo de macrófagos similares a M1 y M2 dentro del TME (n = 7 muestras biológicamente independientes). d, e Proporciones celulares de células NK en células CD45+ (d) y células dendríticas (DC) que expresan CD80/CD86 (e) en tumores (n = 8/grupo). f, g Frecuencia de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) granulocíticas y monocíticas (gMDSC y mMDSC, respectivamente) en tumores (n = 8 muestras biológicamente independientes). h Gráficos de dispersión de citometría de flujo y cuantificación de la expresión de CD80/CD86 por las CD en los ganglios linfáticos que drenan tumores (TDLN) (n = 8 muestras biológicamente independientes). i Frecuencia de células T CD3+CD8+ y CD3+CD4+ y proporción de células T citotóxicas CD8+ versus células T CD4+ (n = 8 muestras/grupo) en TDLN después del tratamiento. j Perfiles de polarización de macrófagos en TDLN (n = 8 muestras biológicamente independientes). k – m Los esplenocitos de ratones en cada grupo de tratamiento se analizaron el día 10 mediante citometría de flujo para examinar la frecuencia de las células T CD4+ y CD8+ (k), CD activadas que expresan moléculas coestimuladoras CD80/CD86 (l) y macrófagos similares a M1 y M2. (m) también se analizaron en el bazo. n = 8 muestras biológicamente independientes. En a–m, los datos se presentan como la media ± sd y se analizan estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar más a fondo la capacidad del SAProsoma-3 para activar células presentadoras de antígenos in vivo, aislamos ganglios linfáticos que drenan tumores (TDLN) de ratones para análisis de citometría de flujo. La proporción de CD maduras, como lo indican las CD CD80+/CD86+, en el TDLN de ratones tratados con SAProsoma-3 fue 3,0 o 2,1 veces mayor que la de los ratones tratados con solución salina o MSA-2 libre, respectivamente (Fig. 4h ). SAProsoma-3 inyectado por vía intravenosa elevó significativamente el número de células T CD8 + y promovió la repolarización de macrófagos de M2 ​​a M1 en TDLN (Fig. 4i, j). Además, se observaron niveles significativamente elevados de células T CD8 + y la maduración de CD robustas, así como la promoción de la repolarización de M2 ​​a M1 en el bazo (Fig. 4k-m). En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia convincente de que SAProsoma-3 desencadena una fuerte activación inmune, contribuyendo así a la regresión tumoral sostenida en el modelo preclínico MC38 utilizado aquí.

Uno de los problemas más difíciles que se encuentran en oncología es la recurrencia del cáncer debido a las metástasis, que ocurren en numerosos pacientes a pesar de la extirpación exitosa del tumor primario. Por lo tanto, evaluamos la eficacia terapéutica de SAProsome-3 en este entorno clínicamente importante después de la resección quirúrgica de tumores primarios y metastásicos tempranos. Con este fin, se estableció un modelo de cáncer de mama ortotópico triple negativo con metástasis espontánea mediante la inoculación de células 4T1 (4T1-luc) que expresan luciferasa en las almohadillas de grasa mamaria de ratones BALB/c singénicos inmunocompetentes (Fig. 5a) 39. SAProsoma-3 indujo eficazmente la regresión sostenida de tumores primarios (Fig. 5b) con un crecimiento estable del peso corporal (Fig. Suplementaria S21) en este modelo; Este resultado fue respaldado aún más por la bioluminiscencia negativa en el grupo de tratamiento (Fig. 5c y Fig. Suplementaria S22). El día 13, los tumores ortotópicos se resecaron quirúrgicamente y posteriormente se realizaron imágenes de bioluminiscencia in vivo después de la cirugía para visualizar la carga metastásica (Fig. 5d). SAProsoma-3 demostró una marcada eficacia terapéutica en la inhibición de metástasis tumorales sin señales de bioluminiscencia detectables derivadas de células 4T1 en comparación con las observadas en ratones tratados solo con MSA-2. Es importante destacar que la tasa de supervivencia en el grupo de tratamiento con SAProsoma-3 experimentó un aumento significativo al 100% (n = 5) en 120 días (Fig. 5e).

a Ilustración esquemática de la inmunoterapia activadora de STING para el tratamiento de metástasis tumorales espontáneas en el modelo de tumor de mama ortotópico 4T1. Se inocularon células 4T1-luc (2,0 × 105) en las almohadillas de grasa mamaria de ratones BALB/c singénicos. Cuando los tumores 4T1 alcanzaron ~100 mm3 de volumen, los ratones fueron tratados con solución salina (inyección intravenosa), MSA-2 libre (administración oral), profármaco 3 (administración oral) o SAProsoma-3 (inyección intravenosa) los días 0 y 4. El día 12, se resecaron quirúrgicamente los tumores ortotópicos primarios en cada ratón para realizar un seguimiento adicional de las metástasis de las células cancerosas 4T1-luc. Creado con BioRender.com. b Curvas de crecimiento de tumores primarios de ratones portadores de tumores 4T1 en diferentes grupos de tratamiento (n = 5 ratones/grupo). Los datos se presentan como media ± DE y la significación estadística se determinó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). c Imágenes de bioluminiscencia in vivo de ratones con tumores (panel izquierdo) antes de la cirugía y pesos de tumores primarios extirpados (panel derecho). n = 5 animales biológicamente independientes. Los datos se presentan como media ± DE y la significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional. d Imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero para rastrear la carga tumoral en varios ratones tratados con medicamentos. e La supervivencia del ratón se controló durante 120 días después de la cirugía (n = 5 ratones/grupo, prueba de Mantel-Cox de rango logarítmico). f – i Pesos de los órganos, incluidos los del hígado (f), pulmón (g), bazo (h) y ganglios linfáticos que drenan tumores (TDLN) (i) en cada grupo de tratamiento. Los ratones fueron sacrificados el día 30 para la escisión de órganos (n = 3 ratones/grupo). Recuadro: fotografías representativas de órganos extraídos. Se contaron los números de focos metastásicos en los pulmones (g). Las flechas o círculos rojos indican metástasis tumorales. Los datos se presentan como media ± DE y la significación estadística se calculó mediante ANOVA unidireccional. j Análisis histológico de secciones de órganos mediante tinción H&E para examinar metástasis. Las imágenes del panel derecho son la ampliación de la región en el rectángulo negro. Se realizaron triplicados de forma independiente con resultados similares. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además, examinamos los efectos inhibidores del SAProsoma-3 sobre la carga metastásica del tumor. El peso de los órganos se ha correlacionado con el crecimiento de metástasis. Observamos una disminución significativa del peso de los órganos, como los del hígado, los pulmones y el bazo, y una reducción de las macrometástasis en ratones tratados con SAProsoma-3 (Fig. 5f-h). Además, el tratamiento con SAProsoma-3 produjo pesos TDLN más pequeños en comparación con los observados en otros tratamientos (Fig. 5i). Las secciones de órganos se analizaron histológicamente mediante tinción con H&E para examinar más a fondo la metástasis. Es alentador que los órganos de los ratones tratados con SAProsoma-3 mostraran una morfología normal y no se observaron recurrencias ni nódulos metastásicos (Fig. 5j). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que SAProsome-3 exhibe un potencial considerable para prevenir la recaída metastásica, reduciendo así la mortalidad relacionada con el cáncer y prolongando la supervivencia.

A continuación, intentamos comparar la eficacia terapéutica de SAProsoma-3 versus MSA-2 libre. Se estableció el modelo de tumor de ratón con carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) y los animales fueron tratados con diferentes dosis y vías de administración de terapias. Se observó actividad antitumoral dependiente de la dosis en cada grupo de tratamiento (Fig. 6a y Fig. Suplementaria S23). Curiosamente, en este modelo, todavía observamos la sorprendente potencia del SAProsoma-3 intravenoso, produciendo una regresión tumoral duradera y respuestas completas en el 50 y el 66,7% de los ratones con 35 y 40 mg/kg de dosis equivalentes a MSA-2, respectivamente (Fig. .6a,b). En particular, la dosificación de SAProsoma-3 a 40 mg/kg condujo a una reducción significativa del volumen del tumor a ~30 mm3. En marcado contraste, el MSA-2 libre administrado por vía oral o intravenosa solo mostró una eficacia limitada contra los tumores LLC (Fig. 6a-c y Fig. Suplementaria S23). También confirmamos las dosis de MSA-2 oral a 160 mg/kg, MSA-2 intravenoso a 40 mg/kg y SAProsoma-3 intravenoso a 30 mg/kg (equivalencia de MSA-2), por lo que tenían el antitumoral comparable. eficacia en este modelo animal (Fig. 6a-c). El análisis histológico mediante tinción H&E y etiquetado de células TUNEL positivas reveló una apoptosis intratumoral pronunciada después del tratamiento con SAProsoma-3 (Figura complementaria S24). Además, la administración de SAProsoma-3 mejoró la infiltración de células T CD8+ en los tumores, lo que se correlacionó positivamente con una producción elevada de granzima B (Figura complementaria S24). Nuevamente, se demostró que SAProsoma-3 es seguro para la administración intravenosa respaldado por pesos corporales estables en animales (Fig. 6d).

Los ratones portadores de tumores a – d LLC se trataron con MSA-2 libre mediante administración intravenosa (IV) o sonda oral, y SAProsoma-3 después de una inyección intravenosa en las dosis equivalentes de MSA-2 indicadas. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral (a), los diagramas de araña de las curvas de crecimiento tumoral individuales (b), las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (prueba de rango logarítmico bilateral) (c) y los cambios de peso corporal (d) de ratones portadores de tumores ( n = 6 ratones/grupo). e – h A ratones con tumores B16F10 subcutáneos de ~ 150 mm3 se les administró una dosis única de solución salina (IV), MSA-2 libre (VO) o SAProsoma3 (IV) equivalente a 35 mg/kg de MSA-2. Para el tratamiento combinado con el anticuerpo de bloqueo del punto de control, a los ratones se les administró adicionalmente anticuerpo anti-PD-L1 por vía intraperitoneal tres veces a una dosis de 5 mg/kg (n = 6 ratones/grupo). f Curvas de crecimiento tumoral para ratones individuales. g Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (prueba de rangos logarítmicos bilateral). Los ratones fueron tratados con las formulaciones indicadas y se estableció como criterio de valoración un volumen de tumor de 2000 mm3. h Cambio de peso corporal de ratones con tumor B16F10 durante el tratamiento (n = 6 ratones/grupo). En (a, d, e, h), los datos se presentan como la media ± sd y se analizan estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El bloqueo de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) o su ligando (PD-L1) con los respectivos anticuerpos se ha mostrado tremendamente prometedor en la clínica. Además, el bloqueo del eje PD1/PD-L1 en combinación con otras modalidades de tratamiento puede generar beneficios terapéuticos adicionales en el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, evaluamos la eficacia del SAProsoma-3 optimizado en combinación con el ICB basado en PD-L1 en un modelo de tumor murino singénico, un melanoma tumoral B16F10 inmunológicamente frío y con poca respuesta al ICB en ratones C57BL/640. El tratamiento se inició cuando el volumen de los tumores subcutáneos alcanzó entre 100 y 200 mm3. La administración de monoterapia a estos tumores establecidos con un anticuerpo anti-PD-L1 (αPD-L1) o MSA-2 libre retrasó solo parcialmente su crecimiento (Fig. 6e, f). Sorprendentemente, el tratamiento con SAProsoma-3 condujo a una supresión tumoral sólida en comparación con la observada con el tratamiento con MSA-2 libre (p. ej., inhibición del crecimiento tumoral en el día 10 del 92,3 % y 24,4 % con los tratamientos con SAProsoma-3 y MSA-2, respectivamente) ( Figura 6e)41. En particular, la terapia combinada erradicó grandes tumores establecidos en ratones el día 10 después de la administración de SAProsoma-3 y αPD-L1, mientras que la eficacia duró durante todo el período de observación (Fig. 6e, f). Los ratones de todos los grupos mantuvieron un crecimiento de peso corporal normal, lo que indica que los tratamientos no indujeron toxicidad grave (Fig. 6g). Además, la MST de los ratones tratados con la terapia combinada se prolongó a 27 días en comparación con la de otros grupos (p. ej., solución salina MST = 10 días) (Fig. 6h)42. Estos resultados respaldan la sinergia entre la inhibición de PD-L1 y la activación de STING mediada por SAProsoma-3 para provocar una inmunidad antitumoral sistémica sólida.

Exploramos más a fondo el mecanismo de administración liposomal para mejorar la inmunidad antitumoral observada en múltiples modelos in vivo mediante la investigación de los perfiles farmacocinéticos y la distribución de fármacos en tumores y ganglios linfáticos. Los perfiles farmacocinéticos del SAProsoma en ratas Sprague-Dawley después de una única inyección intravenosa se determinaron midiendo las concentraciones plasmáticas del fármaco43. Para comparación, se incluyó MSA-2 libre administrado por vía oral o intravenosa. La concentración plasmática de MSA-2 total frente al tiempo y los parámetros farmacocinéticos relacionados se muestran en las figuras 7a, b, respectivamente. Sorprendentemente, los profármacos MSA-2 administrados en liposomas exhibieron una circulación sistémica prolongada con vidas medias que oscilaron entre 4,61 y 5,95 h, entre 5,6 y 7,3 veces más que las observadas después de la inyección intravenosa de MSA-2 (t1/2 = 0,82 h). . En particular, el área bajo la curva de concentración versus tiempo (AUC0–t) reveló que SAProsoma-3 demostró el AUC0–t más alto, 10,6 veces mayor que el observado con MSA-2 administrado por vía oral.

a Concentración del fármaco en plasma de ratas Sprague-Dawley (n = 3 ratas/grupo) después de una administración única de diferentes fármacos a una dosis equivalente de 17,5 mg/kg de MSA-2. Los datos se presentan como ± sd de la media. b Parámetros farmacocinéticos que reflejan la vida media (t1/2), C0, Cmax, área bajo la curva (AUC0-t) y tiempo de residencia medio (MRT). Los ratones con tumores de xenoinjerto MC38 (c), 4T1 (d) o B16F10 (e) recibieron una dosis única de MSA-2 y SAProsoma-3 (n = 6 ratones/grupo). La concentración del fármaco en tumores y ganglios linfáticos se determinó mediante análisis por HPLC a las 8 y 24 h después de la administración. Los datos se presentan como media ± DE y se analizan estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional. f, g Se trataron ratones C57BL/6 con MSA-2 libre por vía oral a una dosis de 240 mg/kg o por vía intravenosa a una dosis de 60 mg/kg, y SAProsoma-3 por vía intravenosa a una dosis de 45 mg/kg por ratón. cada tres días para un total de tres inyecciones (n = 4 ratones/grupo). La química sanguínea de los ratones se analizó el día 8 después de la administración. El diagrama de caja transmite la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y el rango de mínimo a máximo (bigotes). Los datos se analizan estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional. h Los niveles de interleucina 6 (IL-6) en el suero y otros tejidos se determinaron mediante ELISA a las 6 h después de la administración de MSA-2 libre (VO, 240 mg/kg), MSA-2 libre (IV, 60 mg/kg ) o SAProsoma-3 (IV, 45 mg/kg) (n = 5). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para aclarar si la propiedad farmacocinética mejorada de los SAProsomas puede beneficiar la distribución favorable del fármaco en los tejidos diana, se investigó la concentración de MSA-2 tanto en los tumores como en los ganglios linfáticos después del tratamiento en múltiples modelos de ratones con tumores. El MSA-2 libre administrado mediante inyección intravenosa o sonda forzada mostró una acumulación comparativamente baja en los compartimentos tumoral y linfoide en todos los ratones analizados (Fig. 7c-e). Por el contrario, el uso de SAProsomas aumentó sustancialmente la concentración de MSA-2 en estos tumores a 19,0 a 45,1 veces mayor que la encontrada después de la inyección intravenosa de MSA-2 libre, validando así nuestra lógica de diseño del uso de derivatización química de fármacos y administración basada en liposomas. . Como una idea de las diferencias cuantitativas entre los SAProsomas y los tratamientos orales con MSA-2, observamos una acumulación de fármaco entre 22,0 y 449,1 veces mayor en los tumores después de la administración de SAProsoma-3, lo que contribuyó a la eficacia antitumoral notablemente mejorada de MSA-2. Por otro lado, SAProsoma-3 tuvo una distribución baja en otros órganos normales, mientras que MSA-2 administrado por vía intravenosa se acumuló en una concentración más alta en el corazón y los riñones (Figura complementaria S25).

Finalmente, investigamos la toxicidad potencial inducida por la administración sistémica de agonistas de STING. Se probó el mismo esquema de administración con una dosis 1,5 veces mayor que las dosis terapéuticamente relevantes utilizadas en el modelo LLC. El análisis bioquímico del suero mostró que después del tratamiento con SAProsoma-3, todos los parámetros permanecieron sin cambios en comparación con el grupo sano (Fig. 7f, g). Por el contrario, los animales que recibieron MSA-2 intravenoso experimentaron aumentos significativos en la aspartato aminotransferasa (AST) y la alanina aminotransferasa (ALT), lo que indica toxicidades hepáticas obvias. Además, la administración oral de MSA-2 también resultó en niveles de enzimas séricas significativamente elevados, incluidos AST, ALT, ácido urinario (UA) y nitrógeno ureico en sangre (BUN). El examen histológico de las secciones de órganos también sugirió toxicidades obvias para los tejidos del hígado y el riñón después del tratamiento con MSA-2 libre mediante administración intravenosa u oral, mientras que los tratados con SAProsoma-3 no se distinguían de los animales no tratados (Figura complementaria S26). Encontramos inflamación aguda en los grupos tratados con fármacos libres, caracterizada por niveles elevados de citocinas/quimiocinas inflamatorias (Fig. 7h y Fig. Suplementaria S27). Es de destacar que la interleucina 6 (IL-6, un factor clave de la tormenta de citocinas) mantuvo un nivel 12,5 o 18,6 veces mayor en el suero de ratones tratados con MSA-2 por vía oral o intravenosa en comparación con el de SAProsoma-3 (Fig. 7h ). Por el contrario, SAProsoma-3 mostró una fluctuación insignificante de estas citocinas/quimiocinas en suero y órganos sanos, lo que indica inflamación sistémica e inmunotoxicidades minimizadas.

La inmunoterapia ha tenido un impacto tremendo en el tratamiento de una amplia gama de cánceres, incluido el cáncer metastásico. Sin embargo, la monoterapia con ICB clínicamente aprobada en poblaciones no seleccionadas de pacientes con cáncer demostró tasas de respuesta reducidas. Esta respuesta desfavorable se debe a varios factores, como un bajo número de neoantígenos inmunogénicos, múltiples características inmunosupresoras en el TME y escasez de linfocitos infiltrantes de tumores44. En consecuencia, esto provocó esfuerzos para desarrollar nuevas opciones de tratamiento para combatir el cáncer que no responde al ICB. La preparación de la inmunidad innata genera potencialmente una mayor inmunidad adaptativa antitumoral, lo que induce un aumento de los linfocitos infiltrantes de tumores y respuestas al tratamiento más fuertes45. Como regulador inmunológico innato, la proteína STING es un sensor crítico de moléculas de ADN propias y derivadas de patógenos, lo que desencadena numerosas vías de defensa del huésped contra virus o bacterias. Además, la inmunidad mediada por STING puede aprovecharse para el desarrollo de inmunoterapias antitumorales46. La activación de STING a través de agonistas desencadena eventos de señalización posteriores, lo que genera una mayor secreción de citocinas, incluidos los IFN tipo I, que son esenciales para los efectos inmunoterapéuticos. Recientemente, se han dedicado esfuerzos sustanciales al descubrimiento de agonistas de STING y diversos vehículos de administración sofisticados como terapias antitumorales47,48,49,50. Los agonistas basados ​​en CDN son hidrófilos y tienen carga negativa, la formulación de nanopartículas y la administración sistémica de estos agentes polares con fines terapéuticos siguen siendo un desafío. Además, la síntesis escalable de análogos de cGAMP ha planteado obstáculos sustanciales, requiriendo un protocolo de síntesis largo y tedioso debido a sus estructuras polares funcionalmente densas51. Por el contrario, la estrategia sintética para estos profármacos MSA-2 no nucleotídicos descritos en el presente documento es sencilla y puede producirse fácilmente en una escala de gramos a partir de reactivos disponibles comercialmente. Por lo tanto, podemos esperar que estos compuestos sean de gran interés para una mayor traducción clínica.

La administración oral de MSA-2 solo logró bajas respuestas terapéuticas en modelos animales, necesitando una dosis más alta para el tratamiento24. Nuestros intentos iniciales de encapsular MSA-2 en nanoportadores de última generación, como liposomas o micelas poliméricas, fracasaron debido a la baja miscibilidad de MSA-2 con estas matrices. Presumimos que el resto carboxilo (10-OH) en la molécula MSA-2 puede explicar esta incompatibilidad. Esto nos motivó a rediseñar racionalmente este agonista para la formulación adaptativa de nanopartículas. Inicialmente explotamos un motivo de tocoferol hidrofóbico para construir un derivado de MSA-2 (es decir, profármaco 5) (Figura complementaria S28). Desafortunadamente, el profármaco 5 resultante no logró promover la maduración de las CD ni desencadenar la secreción de IFN tipo I. La velocidad de hidrólisis del enlace éster en este armazón de profármaco fue lenta, lo que inhibió la liberación espontánea de MSA-2 activo después de su absorción por las células. Además, en comparación con el MSA-2 libre administrado por vía oral, el profármaco STING derivado de tocoferol administrado a través de liposomas no logró obtener ventajas terapéuticas adicionales después de la inyección intravenosa (Figura complementaria S29). Estos resultados sugieren un umbral de concentración intracelular alto para la activación de STING y la activación lenta y sostenida de MSA-2 atenúa su eficiencia como activador de STING. Estos hallazgos preliminares nos llevaron a plantear la hipótesis de que se pueden provocar respuestas inmunes sólidas mejorando las eficiencias de activación de los fármacos mediante la optimización de la química del conector y de las entidades profármacos generales.

Inspirándonos en esta hipótesis, explotamos alcanoles de tipo MP con diferentes longitudes de cadena de hidrocarburos como promotores para rediseñar químicamente el compuesto MSA-2. Se esperaba que los profármacos resultantes exhibieran una menor hidrofobicidad, menos impedimento estérico y más accesibilidad para la hidrólisis de esterasa que los encontrados con el profármaco derivado de tocoferol. Sorprendentemente, encontramos que estos profármacos conducían a la escisión de enlaces catalizada por esterasa, regenerando espontáneamente fármacos biológicamente activos. Curiosamente, también encontramos que la cinética de activación del fármaco dependía del número de carbonos en el conector del profármaco. En comparación con el compuesto 5, se observaron perfiles de liberación acelerada para estos profármacos (Figura complementaria S30); por ejemplo, aproximadamente el 90 % de los profármacos 3 o 4 se convirtieron en MSA-2 libre en 30 minutos en presencia de esterasa. La rápida tasa de conversión catalizada por esterasa benefició su capacidad para activar STING y así iniciar la producción posterior de IFN tipo I, como lo demuestran varios ensayos basados ​​en células in vitro. En particular, en comparación con los desafíos sustanciales que plantea la síntesis escalable de análogos de cGAMP, el protocolo de síntesis de los profármacos agonistas presentados aquí es sencillo. Estos derivados se pueden producir fácilmente en una escala de gramos a partir de reactivos disponibles comercialmente mediante un protocolo de reacción de dos pasos y, por lo tanto, son beneficiosos para facilitar una traducción clínica adicional.

Los liposomas representan los vehículos de administración de fármacos más prometedores para uso clínico52. Actualmente, hay numerosas formulaciones de liposomas disponibles en el mercado para el tratamiento de enfermedades, y más formulaciones están entrando en desarrollo preclínico y clínico. Contrariamente a la inmiscibilidad del MSA-2 libre con los constituyentes lipídicos, el profármaco STING puede limitarse de manera estable a vesículas liposomales para permitir la inyección intravenosa para la investigación in vivo. La administración intravenosa de vesículas liposomales activadoras de STING mejoró sustancialmente las propiedades farmacocinéticas y la eficiencia de administración favorable de MSA-2 en los tumores o ganglios linfáticos de múltiples modelos de tumores en comparación con la encontrada con la administración de MSA-2 libre. En particular, SAProsome-3 superó a los otros SAProsomas. Revelamos que las estructuras químicas generales de los profármacos afectaron la cinética de hidrólisis y la activación de MSA-2 en respuesta a la esterasa. De hecho, en este estudio se observó una correlación positiva entre la tasa de hidrólisis y la actividad estimulante de STING. Además, SAProsoma-3 tuvo el AUC0-t más alto, lo que podría, en parte, explicar su eficacia antitumoral superior. A pesar de estos hallazgos, las relaciones estructura-actividad aún deben explorarse en profundidad. Además, de acuerdo con estos resultados, el SAProsoma-3 administrado por vía intravenosa provocó una vigorosa remisión del tumor en modelos murinos MC38 y LLC y permitió la erradicación completa de los tumores establecidos. Mecánicamente, el tratamiento con SAProsoma-3 promovió una respuesta inmune innata impulsada por IFN tipo I, transformando así tumores inmunológicamente fríos en calientes. Después del tratamiento con SAProsoma-3, observamos un aumento de la infiltración tumoral por células T funcionales, células NK y CD activadas, así como un cambio en la polarización de los macrófagos de fenotipos protumorigénicos M2 a antitumorales M1, todo lo cual contribuyó a un fuerte efecto antitumoral. respuesta inmune en este modelo MC38. En particular, en los tumores 4T1 y B16F10, que se consideran inmunológicamente silenciosos y no susceptibles de monoterapia con ICB, la administración intravenosa del SAProsoma-3 optimizado suprimió eficazmente el crecimiento tumoral y la carga metastásica, creando sinergia adicional con la inhibición del punto de control inmunológico αPD-L1 para mejorar beneficio terapéutico.

Aunque la administración intratumoral de agonistas de STING puede mitigar las toxicidades sistémicas, esta vía de administración está restringida a pacientes con tumores sólidos accesibles. Nuestros resultados experimentales proporcionan una prueba de concepto para que los agonistas de STING de baja eficiencia se reutilicen y optimicen estructuralmente para generar nanoterapéuticas de alta eficacia inyectables sistémicamente para abordar sus mecanismos de escape inmunológico. Además, dada la actividad oral significativamente mejorada del profármaco 3 observada en los experimentos, se puede prever una rápida evaluación de la eficacia del uso de este compuesto mediante administración oral. Tras la evaluación de seguridad, se justifican ensayos clínicos prospectivos para investigar los liposomas activadores de STING optimizados solos o en combinación con otras inmunoterapias.

Esta investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes. Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang.

C57BL/6 (macho, 4–6 semanas, 18–20 g, #ZJCLA-202004), ratones BALB/c (hembra, 4–6 semanas, 15–18 g, #ZJCLA-202101) y ratas Sprague-Dawley ( macho, 6 a 8 semanas, 200 a 220 g, # ZJCLA-202003) se compraron en el Centro de animales de laboratorio de la Facultad de Medicina de Hangzhou (Hangzhou, China). Los animales se criaron en un centro experimental de animales específico libre de patógenos y se les permitió libre acceso a alimentos y agua. Todos los animales experimentales/de control se alojaron en un hábitat en condiciones estándar (23–26 °C, 40–60% de humedad, ciclo de luz-oscuridad de 12 h y 3–4 ratones o ratas/jaula). Al final del estudio, la eutanasia animal se realizó mediante inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical.

Las estructuras químicas de los profármacos MSA-2 sintetizados se caracterizaron mediante resonancia magnética nuclear de protones y espectrometría de masas de alta resolución. Los procedimientos sintéticos se describen en detalle en los Materiales y métodos complementarios.

Los sapsosomas se prepararon según un método de dilución con etanol, como se describió anteriormente. Brevemente, primero, se preparó una mezcla lipídica de fosfatidilcolina de huevo, colesterol y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-poli(etilenglicol)2000 en etanol (0,9 ml) en una proporción de masa de 7:2:1. A continuación, se añadieron 0,1 ml de dimetilsulfóxido que contenía profármaco MSA-2 (20 mg/ml, equivalente a MSA-2) a la solución etanólica anterior en una proporción de lípidos a MSA-2 fijada en 14:1 (p/p). ). Luego, la mezcla (1 ml) se inyectó rápidamente en PBS (9 ml, pH = 7,4), produciendo liposomas estables en PBS con una concentración equivalente a MSA-2 de 0,2 mg/ml. Finalmente, los SAProsomas resultantes se volvieron a precipitar a 100.000 x g durante 30 minutos mediante ultracentrifugación (Berkman, Optima ™ L-100 XP Ultracentrifuge) y se lavaron con PBS tres veces para eliminar los disolventes orgánicos. La concentración del fármaco se determinó mediante cromatografía líquida analítica de alta resolución (HPLC).

Las células THP1 de la línea celular de monocitos humanos y las células LLC se adquirieron del Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China) y se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. La línea celular B16F10-OVA se adquirió de Crisprbio (Beijing, China). Los cultivos primarios de BMDC se establecieron a partir de ratones hembra C57BL/6. Brevemente, se lavó la médula ósea de fémures aislados utilizando PBS. La médula se sembró en placas de Petri que contenían medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1% de penicilina-estreptomicina, 5 ng/ml de interleucina-4 y 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos murinos. La mitad del volumen del medio de cultivo se renovó el día 3. Las fracciones celulares no adherentes de estos cultivos (típicamente >75% CD11c+ usando citometría de flujo) se usaron para experimentos entre los días 6 y 8 de cultivo. Todas las células se cultivaron en una atmósfera húmeda a 37 °C y 5% de CO2.

Para cuantificar la absorción celular relativa de MSA-2, se sembraron células BMDC y THP1 (4 x 105/por pocillo) en una placa de 24 pocillos, se trataron con las formulaciones indicadas a 40 µM de MSA-2 y luego se suspendieron en PBS y analizado mediante citometría de flujo (DxFLEX, Beckman Coulter) utilizando un láser de excitación de 405 nm y una configuración de filtro de 450/45 nm.

Los ratones fueron inoculados por vía subcutánea con 5 x 106 células MC38 en el flanco derecho. El tamaño del tumor se midió cada 2 días utilizando un calibrador digital y el volumen del tumor se calculó como 0,5 × largo × ancho2. Al alcanzar tamaños de ~100 mm3, los animales fueron distribuidos aleatoriamente en seis grupos (n = 10 en cada grupo). Se administraron por vía intravenosa tres inyecciones de diferentes SAProsomas a través de la vena de la cola a una dosis de MSA-2 de 35 mg/kg los días 0, 4 y 8, mientras que se administró MSA-2 libre por vía oral y se inyectó solución salina por vía intravenosa como controles. El crecimiento del tumor y el peso corporal se controlaron y registraron cada 2 días. Los ratones fueron sacrificados de acuerdo con las pautas de ética animal de nuestro instituto y las normas de bienestar animal cuando el volumen del tumor alcanzó los 2000 mm3. Los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2 al final del estudio.

Para el análisis histológico, los tumores y órganos extirpados se fijaron en paraformaldehído al 4% en tampón fosfato, se incluyeron en parafina y se seccionaron en cortes de 5 μm de espesor. Las secciones de tumores y órganos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Para el ensayo de marcado del extremo de muesca dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL), las secciones tumorales desparafinadas y rehidratadas se incubaron con proteinasa K durante 15 minutos a 37 °C, se enjuagaron con PBS dos veces y se enjuagaron con el sistema de detección de muerte celular in situ TUNEL. kit según protocolo del fabricante (Sigma-Aldrich). Las células teñidas con TUNEL se tiñeron con diaminobencidina (DAKO). Para evaluar la infiltración de células inmunitarias, las muestras se fijaron y tiñeron con anticuerpos (CD8a y Granzyme B, Biolegend) y DAPI. Se tomaron imágenes de los portaobjetos utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus, IX71).

Las concentraciones plasmáticas de SAProsomas (a una dosis equivalente de MSA-2 de 17,5 mg/kg) administradas por vía intravenosa se compararon con las de MSA-2 libre (17,5 mg/kg) administradas por vía oral o intravenosa en ratas Sprague-Dawley (~200 g, n = 3 en cada grupo). Después del tratamiento farmacológico, se recogieron muestras de sangre en momentos predeterminados y se centrifugaron inmediatamente durante 10 minutos a 3000 × g, y las muestras de plasma resultantes se recogieron en tubos de microcentrífuga. Las concentraciones de MSA-2 y profármaco después de la hidrólisis completa se analizaron mediante HPLC de fase inversa.

Se empleó el software Prism versión 8.0 (GraphPad) para realizar todos los análisis estadísticos. A menos que se indique lo contrario, los datos se presentan como ± error estándar de la media. La significación estadística entre las mediciones se evaluó mediante la prueba t de Student no apareada o el análisis de varianza unidireccional. Los estudios de supervivencia se analizaron mediante gráficos de Kaplan-Meier.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y/o en los materiales complementarios. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones 82273490, 82073296 y 81773193 para HW), el Proyecto de Investigación del Laboratorio de Biomedicina Microecológica de Shandong de Jinan (Subvención JNL-2022010B para HW) y la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Zhejiang de China. (Conceda LR19H160002 a HW). Agradecemos la asistencia técnica del Centro de Microscopía Crioelectrónica (CCEM), Universidad de Zhejiang, para el análisis TEM. Agradecemos a Zhaoxiaonan Lin de Core Facilities, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang por su apoyo técnico.

El primer hospital afiliado, laboratorio clave del NHC para trasplantes combinados de múltiples órganos, centro de innovación colaborativa para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, laboratorio clave estatal para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, facultad de medicina de la Universidad de Zhejiang, 310003, Hangzhou, provincia de Zhejiang. R. P. de China

Xiaona Chen, Fanchao Meng, Yiting Xu, Tongyu Li, Xiaolong Chen y Hangxiang Wang

Laboratorio Shandong de Biomedicina Microecológica de Jinan, 250117, Jinan, Provincia de Shandong, República Popular China

Hangxiang Wang

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HW concibió y diseñó la investigación; Xiaona Chen realizó la mayoría de los experimentos; FM, YX y Xiaolong Chen ayudaron a realizar la investigación; Xiaona Chen, FM, YX, Xiaolong Chen, TL y HW analizaron los datos; Xiaona Chen y HW escribieron y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Hangxiang Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Chen, X., Meng, F., Xu, Y. et al. Las vesículas nanoliposomales activadoras de STING químicamente programadas mejoran la inmunidad anticancerígena. Nat Comuna 14, 4584 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40312-y

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Recibido: 02 de noviembre de 2022

Aceptado: 20 de julio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40312-y

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